За расплетение молекулы днк ответственен фермент какой

Обновлено: 30.06.2024

Культуру бактерий Е. соН выращивали в течение длительного времени на среде, содержащей азот 15Ы. Затем клетки перенесли на среду с 14N1 где нарас! или их в течение одной генерации.

а) по консервативному типу;

б) по полуконсервативному типу;

Как распределится метка после выращивания бактерий на среде с легким азотом 14И после двух генераций при предположении, что репликация происходит по:

а) консервативному типу;

б) полуконсервативному типу;

Фермент ДНК-полимеразы I принимает участие в репликации ДНК.

Имеет ли этот фермент иную активность, кроме ДНК-полиме- разной?

Как работает этот фермент т ут??

Важна ли активность ДНК-полимеразы I для клеток Е. со1П Почему?

Как называется фермент, ответственный за синтез ДНК как при репликации, так и при репарации?

У бактерий Е.соИ вновь синтезированная ДНК кратковременно обнаруживается в виде фрагментов длиной 1000 - 2 ООО нуклеотидов. Какое они имеют название?

Для запуска синтеза ДНК с участием ДНК-полимеразы III в отличие от синтеза РНК с помощью РНК-полимеразы совершенно необходимо определенное строение молекулы ДНК. Какое?

Расплетение двойной спирали ДНК в зоне репликативной вилки катализируется ферментом, использующим для направленного движения по ДНК энергию гидролиза АТФ. Как называется этот фермент?

Для бактерий и некоторых вирусов, инфицирующих эукариотические клетки, было показано, что репликационные глазки образуются в тех участках молекулы ДНК, где находятся специальные последовательности.

Укажите, верно ли утверждение, что у Е. соИ репликативная вилка продвигается вперед со скоростью 500 - 1000 пар нуклеотидов (п. н.) в секунду, а цепи ДНК перед вилкой вращаются с круговой скоростью почти 3000 об/мин.

Укажите, верно ли утверждение, что при утрате ДНК-полимера- зой (3'—>50 экзонуклеазной активности клетками Е. соИ должна уменьшиться скорость синтеза ДНК, но не его точность.

Укажите, верно ли утверждение, что в клетках дрожжей, мутантных по гопоизомеразе II, ДНК может реплицироваться, но хромосомы не могут разделяться в процессе митоза.

Самая большая хромосома П. те1апо$а$1ег имеет 6,5 х 10 пар нуклеотидов (п. п.). Скорость репликации ДНК у дрозофилы 2 600 п. н. в минуту 1гри 25 °С. В период активного роста дрозофилы ее хромосомы могут удваиваться практически через каждые 5—7 ч. Почему?

Скорость репликации ДНК в клетках дрозофилы на самом деле гораздо выше и равна 2,1 х Ю5п. н. в секунду.

Б. В период активного роста у дрозофилы нарушен клеточный цикл. Репликация хромосом идет практически непрерывно.

Каждая молекула ДНК в хромосоме дрозофилы имеет более 2000 точек ог/^ш-репликации.

Г. С такой скоростью образуются только политеиные хромосомы.

Д. Хромосомы в активно делящихся клетках дрозофилы реплицируются через 10-12 дней.

Культуру бактерий Е. соН вырастили в течение длительного времени на среде, содержащей азот N. Затем клетки перенесли на среду ,с 14И, где они находились в течение одной генерации. После этого клетки вновь поместили на среду с /5Л^, на время, соответствующее одной генерации. Затем из бактерий выделили ДНК, подвергли центрифугирова-нию в градиенте плотности СзС1 и проанализировали распределение радиоактивной метки (рис. 15). Какую картину можно увидеть при анализе полученного препарата?

А Б В Г Д Е ¦¦ « 15* 15* 15* 14* 14*15* — 14*15* 14*15* 14*15* — 14* 15* — 15* ч_/ Рис. 15. Распределение радиоактивной метки после центрифугирования проб ДНК в градиентеС&С1

Систему синтеза ДНК ш укго использовали для изучения репликации вирусного генома, представленного двухнитчатой кольцевой молекулой ДНК.

Рис. 16. Рестрикционная карта кольцевого генома вируса

Репликацию осуществляли, используя в качестве матрицы вирусную ДНК, экстракты инфицированных клеток в качестве источника ферментов, а также нуклеотидтрифосфаты (дГТФ, дЦТФ, дАТФ, дТТФ и АТФ), меченные ЛР. После этого продукты реакции, обработанные рестриктазой МЪо1, подвергли электрофоретическому разделению и визуализировали с помощью радиоаутографии (рис. 17, колонка 1). Аналогичная реакция проводилась в присутствии насыщающей концентрации немеченого 2',3-дидезоксиГТФ (ддГТФ) (рис. 17, колонки 2-4).

Рис. 17. Электрофореграмма МЬо/-фрагментов, полученных после репликации вирусного генома в присутствии меченых дезоксирибонуклеотидов (колонка 1), а также при насыщающей концентрации немеченого ддГТФ (колонки 2-4)

Судя по результатам рис. 17, точка оп^ш-решшкации находится на фрагменте:

Задание 1. РЕПЛИКАЦИЯ ДНК У БАКТЕРИЙ

Использование градиента плотности хлорида цезия при ультрацен-трифугировании позволяет достаточно хорошо разделить даже такие вещества, плотности которых весьма близки. Этот методический прием использовали для разделения ДНК, меченной Ы15, и ДНК, содержащей обычный изотоп азота (,4Щ.

Культуру клеток Е. соН равномерно метили 15Ы, выращивая клетки в течение 14 генераций на среде с ,5ИН4С1. Затем эту среду заменяли средой, содержащей 14NN^01. При центрифугировании в градиенте плотности ДНК, выделенной из клеток, взятых с радиоактивной среды, обнаруживался гомогенный пик ДНК, по плотности соответствующий меченной /5Л/ ДНК.

После переноса на сред>' с 14N брали пробы клеток, выделяли из них ДНК и анализировали ее в градиенте плотности. При этом обнаруживали 3 пика ДНК с различной плотностью. Первый соответствовал меченой ДНК; второй - немеченой, а третий являлся промежуточным между первыми двумя. Относительное содержание этих трех ДНК изменялось в зависимости о г времени, прошедшего после переноса клеток на среду с 14М, как это показано в табл.

Анализ в градиенте плот ности ДНК, выделенной из клеток Е. соИ после перевода бактерий с /5Л- на /4Л-еодержащую среду Время,

мин % о г общего количесгна ДНК легкой

^Л^-фракции промежуточной фракции, % общей ДНК тяжелой

,5Л'-фракшш 0 0 0 100 13 0 31 69 20 0 48 52 28 0 70 30 44 2 98 0 61 27 73 0 80 50 50 0 100 61 38 0 120 78 23 0 160 88 12 0

Вопрос. Какие выводы можно сделать из представленных в табл. 13 результатов?

Задание 2. РЕПЛИКАЦИЯ ДИК У ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

При исследовании репликации ДНК эукариотических микроорганизмов были получены следующие результаты.

Эксперимент 1.Культуры микроорганизмов выращивали в течение нескольких генераций на среде, все азотистые соединения которой содержали либо обычный азот (14Ы) (I), либо его изотоп (/5Д0 (II). В конце инкубационного периода клетки собирали и выделяли из них ДНК. Примесь РНК удаляли с помощью РНК-азы, после чего препараты ДНК из каждой культуры разделяли на две части. Их смешивали с растворами хлорида цезия (конечная плотность 1,700 г/мл) при рН 7,0 или 12,0 и центрифугировали при 100 000 об/мин в течение 48 ч при 20 °С. Содержимое всех четырех пробирок использовали для определения плотности ДНК в пиках. Результаты опыта приведены в табл. 14.

Содержание г4Н- и 75ЛЧДНК в исследуемом микроорганизме Условия выращива СУС/, рН 7,0 СхС1, рН 12,0 ЛЬ ния Плотность % от обшей Плотность % от общей клеток ДНК, г/мл ДНК ДНК, г/мл ДНК I Клегки, растущие 1,713* 90 1,731 90 па среде с 1,701" 10 1,715 10 П Клетки, растущие на среде с 15М 1,729*

Затем клегки, выращенные на среде, содержащей только азот;5ДГ, переносили на среду с 14N и продолжали инкубацию. Через определенный промежуток времени брали пробы клеток, выделяли из них ДНК, очищали от примесей и анализировали в градиенте плотности хлористого цезия.

Анализ ДНК в градиенте плотности СА’С/ Время после переноса, ч рН 7,0 рН 12 Плотность ДНК, г/мл % от общей ДНК Плотность ДНК, г/мл % от общей ДНК 2 1,729 30 1,746 60 1,721 60 1,731 30 1,715 10 1,729 10 4 1,721 90 1,746 45

Время после переноса, ч рН7,0 рН12 Плотность ДНК, г/мл %от обшей ДНК Плотность ДНК, г/мл %от обшей ДНК 4 1,715 10 1,731 45 1,729 10 6 1,721 60 1,746 30 1,713 30 1,731 60 1,715 10 1,729 10 8 1,721 45 1,746 22 1,713 45 1,731 68 1,715 10 1,729 10 10 1,721 30 1,746 15 1,713 60 1,731 75 1,715 3 1,729 7 1,708 7 1,715 3 12 1,721 22 1,746 11 1,713 68 1,731 79 1,708 10 1,729 5 1,715 5 14 1,721 15 1,746 8 1,713 75 1,731 82 1,708 7 1,729 3 1,701 3 1,715 7 16 1,721 11 1,746 6 1,713 79 1,731 84 1,708 5 1,729 2,5 1,701 5 1,715 7,5

Часть клеток, выращенных на среде сИ, собирали, промывали средой, разрушали, после чего из гомогената методом дифференциального центрифугирования выделяли субклеточные фракции. Из каждой фракции выделяли ДНК и анализировали ее в градиенте плотности хлористого цезия (табл. 16).

Анализ ДНК из субклеточных фракций в градиенте плотности С«С/ Фракция СхС1,рН7,0 СаС1,рН12,0 Плотность ДНК, г/мл % от общей ДНК Плотность ДНК, г/мл % от общей ДНК Ядра 1,713 90 1,731 90 Митохондрии 1,701 10 1,715 10 1,713 следы 1,731 следы

Вопрос 1. Является ли анализируемая ДНК двухцепочечной? Дайте пояснение ответа.

Эксперимент 2. Ядерную и митохондриальную ДНК после цен-трифугирования в СаС1 очищали от примесей и использовали в качестве матриц для синтеза РНК (ядерной и митохондриальной соответственно) из ‘Р-нуклеозидтрифосфатов с помощью РН К-нолимеразы. РНК, синте-зированную на каждой матрице, освобождали от ДНК и подвергали очи-стке. Препарат ядерной ДНК денатурировали при 100 °С в течение 5 мин.

После быстрого охлаждения раствор ДНК фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры. Концентрацию ДНК подбирали таким об-разом.чтобы каждый мембранный фильтр связывал 10 мкг ДНК. Затем фильтры с иммобилизованной на них ДНК гибридизовали в течение но- чи с различными количествами Р-РНК, после чего обрабатывали РНК- азой, промывали, высушивали и измеряли радиоактивность (табл. 17).

В последующих опытах содержащие ДНК мембранные фильтры гибрпдизовали с 20 мкг Р-РНК в присутствии различных количеств немеченой РНК, выделенной из цитоплазматической фракции клеток после удаления из нее митохондрий. После инкубации в течение ночи фильтры обрабатывали РНК-азой, промывали, высушивали и измеряли радиоактивность (габл. 18).

При каких концентрациях Р-РНК достигается насыщение уровня ДНК-РНК гибридизации?

Из кривых насыщения для РНК вычислите количество РНК, связавшейся с данным количеством ДНК для каждого случая. Определите, вся ли молекула ДНК используется в качестве матрицы для синтеза РНК с помощью РНК'ПОЛимеразы.

Задание 3. СИНТЕЗ ДНК В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК

Суспензию культуры клеток инкубировали при 37 °С в течение 30 мин с 1 мкКи 3//-тимидина (10‘6 моль/л). Затем клетки центрифугировали, ресуспендировали в среде с немеченым тимидином (10'5 моль/л) и продолжали инкубацию при 37 °С. Через определенные интервалы времени отбирали пробы для подсчета числа клеток и определения числа меченых митотических клеток с помощью радиоаутографии (табл. 19).

Рост клеток и деление ядер в тканевой культуре Время,

час Число клеток в 1 мл X

о клеток Число клеток, находящихся в мигозе Число меченых митотических клеток 0 125x1О3 450 5 1 475 71 2 460 390 3 480 480 4 145x10Э 450 447 5 490 488 6 500 495 7 465 465 8 170x1О3 480 460 9 460 300 10 450 150 11 480 50 12 190х103 460 10 14 470 5 16 220х103 480 8 18 490 50 20 240x1О3 500 400 22 460 460 24 290x1О3 490 485 26 480 480 28 ЗЗОхЮ3 460 160 30 475 5 32 З70х103 36 440х103 40 500х103 44 560x1О3 48 650x1О3 52 750х103 56 880x1О3 60 1060x1О3

Вопрос 1. Какие выводы вы можете сделать о продолжительности митотического цикла клеток?

Вопрос 2. Отличается ли время деления клеток, полученное на основании анализа кривой роста, от времени появления меченых митотических клеток?

Задание 4. РАЗМНОЖЕНИЕ ВИРУСОВ

Из животных клеток были выделены три различных вируса. Геном каждого из них представлен одноцепочечной РНК. Чтобы охарактеризовать их, было использовано два теста. Во-первых, определена РНК этих вирусов и их способность служить в качестве матрицы для синтеза белка в бссклсточной системе т УМГО. Во-вторых, вы измеряете активность их эндогенных полимераз после разрушения мягким способом интактных вирусных частиц и инкубации с радиоактивными рибонуклеозидтри- фосфатами (чтобы выявить их способность к синтезу РНК), а также с радиоактивными дсзорибонуклеозидтрифосфатами (чтобы определить их способность к синтезу ДНК). Результаты этого исследования представлены в табл. 20. Попробуйте на основании полученных результатов оп-ределить жизненный цикл вирусов и назовите какие-либо известные вирусы с такими же циклами развития.

Характеристика исследуемых видов Номер вируса Синтез

белка Эндогенная полимераза РНК ДНК Вирус 1 - + — Вирус 2 + — — Вирус 3 + - +

Читайте также: