Какой фермент осуществляет лизис тромба

Обновлено: 02.07.2024

В статье представлен краткий исторический обзор развития тромболитической терапии при остром инфаркте миокарда и основные сведения о тромболитических препаратах, присутствующих на отечественном фармацевтическом рынке. Обсуждены результаты проведенных исследований по сравнению этих препаратов. С четом особенностейфармакокинетики и фармакодинамики, а также клинических эффектов предложены возможные алгоритмы выбора тромболитического препарата в некоторых клинических ситуациях.

Тромболитическая терапия (ТЛТ) признана одним из 10 величайших достижений кардиологии XX в. [1]. Несмотря на внедрение первичной коронарной ангиопластики при остром инфаркте миокарда, тромболизис не теряет своего значения с учетом логистических особенностей нашей страны с большими расстояниями до специализированных инвазивных центров. Напротив, масса больных до сих пор остаются вообще без реперфузионных вмешательств, поэтому проблема внедрения тромболизиса продолжает оставаться актуальной для отечественного здравоохранения.

Некоторые исторические аспекты

Классификация тромболитических агентов

По механизму действия все тромболитические средства можно разделить на 3 группы [10]:

Прямые фибринолитики, которые непосредственно разрушают молекулу фибрина. К ним относятся основной естественный фермент тромболитической системы человека плазмин, его лекарственная форма фибринолизин и некоторые грибковые протеазы.

Активаторы плазминогена: СК, стафилокиназа, тканевой активатор плазминогена и активатор плазминогена урокиназного типа.

Вещества третьей группы не вызывают непосредственной активации плазминогена и не оказывают прямого лизирующего воздействия на фибрин. Они усиливают фибринолиз относительно мягко – путем следующих механизмов:

повышения биосинтеза плазминогена или его активаторов (анаболические стероиды, никотиновая кислота);
усиления высвобождения активаторов плазминогена из тканей (гистамин, брадикинин, гепарин, простагландины);
инактивации естественных ингибиторов фибринолиза;
специфических антител, солей тяжелых металлов;
изменения структуры фибриногена или фибрина (Арвин или Анкрод, дефибраза, фибринспецифические антитела).

Из препаратов первой группы в клинической практике использовался только фибринолизин. Выдающимся достижением отечественной кардиологии стало внутрикоронарное введение фибринолизина при ОИМ, которое впервые в мире 5 июня 1975 г. выполнили кардиологи под руководством Е.И. Чазова [11]. В настоящее время в результате появления новых более эффективных препаратов фибринолизин утратил свое значение.

Непрямые фибринолитики активируют фибринолиз достаточно слабо и поэтому в качестве тромболитиков, тем более при остром тромбозе, не используются. Широко применяется только гепарин, но не как активатор фибринолиза, а как антикоагулянт. Для проведения лекарственного тромболизиса при инфаркте миокарда в настоящее время используются только активаторы плазминогена.

Активаторы плазминогена в свою очередь делятся на тромболитики:

1-го поколения (фибриннеспецифичные: СК и УК);
2-го поколения (фибринспецифичные: алтеплаза, проурокиназа, рекомбинантная стафилокиназа);
3-го поколения (генномодифицированные: тенектеплаза, Пуролаза, Фортелизин).

СК: начало многоцентровых клинических исследований

Первым из этих препаратов считается СК. СК образует комплекс с плазмином, молекула которого при этом изменяется и обнажается его активный центр. Комплекс СК–плазминоген играет роль фермента в дальнейшем превращении плазминогена в плазмин, причем он активирует как связанные с фибрином, так и свободно циркулирующие молекулы плазминогена. Как следствие – плазмин лизирует не только фибрин, но и фибриноген, циркулирующий в крови, чем и объясняется снижение фибриногена на фоне тромболизиса. СК антигенна, поэтому титры антистрептокиназных антител быстро нарастают в течение нескольких дней после введения препарата, делая неэффективным и небезопасным его повторное применение.

Напротив, существует мнение, будто снижение АД является маркером эффективности ТЛТ. Чем более эффективна ТЛТ, тем больше образуется не только плазмина, но и брадикинина, тем сильнее должно снижаться АД, хотя статистически это не подтверждено.

было проведено первое многоцентровое исследование эффективности тромболизиса при ОИМ, известное как GISSI-1 [16]. В это итальянское исследование были включены 11 806 больных ОИМ, половине из которых в течение первых 12 часов заболевания было введено 1,5 млн ЕД СК в течение часа. Конечной точкой исследования стала летальность.

Впервые было показано, что:

Применение тромболизиса снижает летальность при ОИМ.

Эффективность тромболизиса зависит от промежутка времени между началом заболевания и введением СК. При начале терапии в первый час заболевания, в первые 2–3 и 3–6 часов летальность составила соответственно 8,2, 9,2 и 11,7% против 14,1% в контрольной группе без ТЛТ. Выходит, чем раньше начинается ТЛТ, тем выше ее эффективность.

Эти выводы принципиально были подтверждены в исследовании ISIS-2 [17]. Более 17 тыс. больных были рандомизированы в 4 группы: СК, аспирина, СК+аспирин и контрольную. Оказалось, что 5-недельная летальность в группе СК снизилась на 25%, в группе аспирина – на 23%, в группе СК+аспирин – на 42%. Т.е. дополнительно к подтверждению эффективности СК была продемонстрирована высокая эффективность аспирина. Результаты вышеперечисленных исследований стали доказательной основой современной стратегии лечения ОИМ: как можно раньше назначать ТЛТ, аспирин и гепарин.

Проведенный мета-анализ результатов исследований с ангиографическим контролем показал, что при введении СК частота реперфузии коронарной артерии (КА) составляет на 60 минут лечения в среднем 44%, на 90 – 48%, через 3 часа – 72%, а от 24 часов до 21 суток – от 75 до 85%, что статистически значимо выше, чем в контрольной группе без тромболизиса [18].

СК или алтеплаза?

Тканевой активатор плазминогена (ТАП), выделенный в начале 1980 гг., – это белок, который синтезируется эндотелиальными клетками сосудов. В отличие от СК, активирующая плазменный плазмингоген, вызывая системное литическое состояние, ТАП переводит тканевой плазминоген в активный тромбин только в присутствии фибрина. Таким образом, он является фибриноспецифичным и не обладает выраженным системным действием, хотя при увеличении дозы препарата эта фибриноспецифичность исчезает. Во время тромболизиса ТАП происходит активная выработка тромбина, что определяет обязательную необходимость комбинировать ТАП с внутривенным введением гепарина. ДНК-рекомбинантным методом был создан промышленный продукт – алтеплаза. В отличие от СК он имеет короткий период инактивации. Период его полураспада составляет 4–8 минут, что требует продолжительного введения для поддержания терапевтической концентрации в крови. При первых испытаниях алтеплазы для лечения ОИМ ее назначали в общей дозе 150 мг в течение 3 часов, затем схему поменяли на 100 мг за 90 минут.

В 1980‑1990-х гг. проводились сравнительные исследования СК и алтеплазы. В нескольких исследованиях с ангиографическим контролем было показано, что 3-часовая инфузия алтеплазы достоверно чаще вызывает реперфузию КА на 60 и 90 минут тромболизиса по сравнению с СК [19]. С учетом важного значения скорости реперфузии КА логично было ожидать снижения летальности в группах с алтеплазой, но в исследованиях TIMI-1 (290 больных), GISSI-2 (10372 пациента), ISSIS-3 (41 299 больных) не было обнаружено достоверного различия в летальности между группами СК и алтеплазы. И только в исследовании GUSTO-I, в которое включен 41 021 больной, показано, что ускоренный режим введения алтеплазы (100 мг за 90 минут) позволил уменьшить 30-дневную летальность по сравнению с СК: 6,3 против 7,2% соответственно (р=0,001), т.е. на 0,9% [20]. Казалось бы, преимущество алтеплазы доказано.

Но такая однозначная оценка результатов ограничена следующими обстоятельствами:

Достоверное различие в смертности наблюдалось только среди больных, которые лечились в США. В других странах такого различия не было [21].

В группе алтеплазы развилось больше инвалидизирующих инсультов: 0,72 против 0,54% (р=0,03). При этом комбинированная конечная точка (смерть+инсульт) в группе алтеплазы все-таки осталась ниже: 6,9 против 7,8% (р=0,006). Повышение частоты геморрагических инсультов при применении фибриноспецифических препаратов ТАП по сравнению с СК отмечено также в более позднем мета-анализе [22].

В рамках исследования GUSTO-I проведено подисследование: 2431 больным выполнялась ангиография. Оказалось, что эффективный кровоток (по ТIMI 2–3) в КА к 90 минам от начала ТЛТ в группе алтеплазы был достигнут в 81% случаев, а в группе СК – только в 60%. Но через 3 часа различия по этому показателю уже не определялось: 74 и 76% соответственно [23]. Таким образом, СК и алтеплаза одинаково часто открывают КА, но алтеплаза делает это чуть быстрее.

Таким образом, к недостаткам алтеплазы по сравнению с СК относятся высокий риск кровоизлияния в мозг, обязательная необходимость параллельной инфузии гепарина и высокая стоимость. Поэтому при выборе алтеплазы для тромболитической терапии необходимо учитывать не только ее достоинства, но и недостатки.

Тенектеплаза – препарат для болюсного введения

Для улучшения фибринолитических характеристик препарата методом генной инженерии были созданы модификации молекулы ТАП: ретеплаза (рекомбинантный активатор плазминогена, r-PA), ланотеплаза (n-PA) и тенектеплаза (TNK-tPA). Наиболее удачный из них – препарат тенектеплаза (Метализе). Это молекула с более продолжительным плазменным периодом полувыведения, повышенной специфичностью к фибрину и большей устойчивостью к ингибитору первого типа активатора плазминогена (PAI-1) по сравнению с естественным ТАП, поэтому несомненным преимуществом тенектеплазы является возможность ее однократного болюсного введения. В исследовании ASSENT-1 была определена наиболее оптимальная доза этого препарата: 30–50 мг в зависимости от веса пациента [25].

С использованием этой дозы в исследовании ASSENT-2 проведено сравнение алтеплазы и тенектеплазы. Хотя частота нецеребральных кровоизлияний и необходимости гемотрансфузий была несколько меньше в группе тенектеплазы, чем алтеплазы, – 26,4 против 28,9% (p=0,0003) и 4,2 против 5,5% (p=0,0002) соответственно, смертность в течение 30 суток в обеих группах не различалась: 6,18 и 6,15% в группе тенектеплазы и алтеплазы соответственно. Частота геморрагических инсультов также не различалась и составила соответственно 1,78 и 1,66%. Был сделан вывод об одинаковой терапевтической эфективности обоих препаратов, но отмечена более простая методика применения нового тромболитика [26].

Таким образом, преимуществом тромболитиков 3-го поколения группы ТАП (тенектеплаза) является не более высокая клиническая эффективность и безопасность, а удобство, простота в применении. Поэтому именно этот препарат позиционируется как единственный специальный тромболитик для догоспитального этапа.

Многоцентровых сравнительных исследований стрептокиназы и тенектеплазы не было. Мы провели одноцентровое сравнительное исследование этих препаратов при их введении на догоспитальном этапе [27]. Частота реперфузии через 90 минут по ЭКГ-признакам оказалась выше в группе тенектеплазы: 64 против 48% (р

Установлена ключевая роль лейкоцитарного фибринолиза в нарушении системы гемостаза при сепсисе, при вирусной патологии, при кардиоваскулярных заболеваниях. Целью нашего исследования явилось изучение нарушений лейкоцитарного фибринолиза у онкологических больных. В работе представлены данные по изучению фибринолитической активности лейкоцитов. Стрептаза повышает фибринолитическую активность нейтрофилов здоровых людей более чем в 3 раза. У онкологических больных понижена фибринолитическая активность нейтрофилов. Они в меньшей степени активируются фибринолитиком, чем клетки от здоровых доноров. Нейтрофилы активно адгезируются к фибрину. Сыворотка от здоровых людей препятствует адгезии нейтрофилов к фибрину. Онкологические больные характеризуются повышенной агрегационной активностью нейтрофилов к фибрину. Нарушение лейкоцитарного фибринолиза у онкологических больных повышает угрозу образования у них тромбов.

1. Кузник Б.И. Клеточные и молекулярные механизмы регуляции системы гемостаза в норме и патологии. – Чита: Экспресс издательство, 2010. – 827 с.

2. Макацария А.Д. Злокачественные новообразования, тромбофилии и тромбозы / А.Д. Макацария, В.О. Воробьев, А.М. Бицадзе – М.: Триада-Х, 2008. – 783 с.

4. Степанов А.В. Механизмы иммунокоррегирующего действия пептидов из лимфоидной ткани при иммунодефицитных состояниях и воспалении : автореф. дис. … д-ра мед. наук. – Иркутск, 1995. – 40 с.

5. Цыбиков Н.Н. Лейкофибринолиз, усиленный адгезией лейкоцитов к сгустку антифибриновыми антителами / Н.Н. Цыбиков, А.В. Краденов // Бюлл. эксперим. биол. и мед. – 1991. – № 5. – С. 12–13.

6. Moir E. Polymorphonuclear leukocytes from patients with severe sepsis have lost the ability to degrade fibrin via u-PA / E. Moir, M. Greaves, G.D. Adey, // Journal of Leukocyte Biologyvol. – 2004. – № 76 no. 3 – Р. 571–576.

7. Nomura E. Leukocytes May Have 2 Opposing Effects in Intravenous rtPA Treatment for Ischemic Stroke / E. Nomura, H. Naka, S.Wakabayashi // Clin Appl Thromb Hemost. – 2012. – № 11 – Р. 571–576.

8. Saha P. Leukocytes and the Natural History of Deep Vein Thrombosis / P. Saha, J. Humphries, B. Modarai // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology – 2011. – № 31 – Р. 506–512.

9. Wohner N. Role of Cellular Elements in Thrombus Formation and Dissolution // Cardiovascul. Hematol. Agents Med. Chemistry. – 2008. – № 6 – Р. 224–228.

10. Zouaoui B.K. Fibrinolysis and cardiovascular risk factors: association with fibrinogen, lipids, and monocyte count // Eur.J. Intern Med. – 2006. – № 17. – Р. 102–110.

Онкологические больные относятся к группе высокого риска по развитию у них тромботических осложнений. Одним из основных методом лечения является проведение лизиса тромбов в сосудах. Однако стандартная тромболитическая терапия не всегда эффективна, что может быть связано с тем, что в сосуде, где располагается тромб или нет кровотока, или же он резко снижен. Поэтому введение фибринолитических агентов в сосудистое русло не может быть достаточно результативным, тромболитик не может достичь тромба. Другим недостатком данного вида терапии является то, что лекарственные препараты приходится вводить в достаточно высоких концентрациях. Причем существенная часть фибринолитика блокируется многочисленными ингибиторами крови, и клиницист не всегда знает уровень этого потенциала. Причем он может существенно отличаться у различных пациентов. Фибринолитическая терапия также может сопровождаться различными осложнениям: кровотечения, развитие инсульта, аллергические реакции и другие [2].

В настоящее время уделяется значительное внимание фибринолизу, осуществляемому белками плазмы крови, однако, по нашему мнению, незаслуженно забыта фибринолитическая активность клеток крови.

В последние годы установлено, что при некоторых патологических состояниях лейкоцитарный фибринолиз играет весьма важную роль. Установлена его ключевая роль в нарушении фибринолиза при сепсисе [6, 9], при вирусной патологии [8], при кардиоваскулярных заболеваниях [10]. Показано также, что внутривенный тромболизис более эффективен при высокой активности и большем количестве нейтрофилов в крови [7]. В других работах установлено, что на фибринолитическую активность нейтрофилов оказывают влияние некоторые пептиды [3, 4].

Цель исследования: изучение нарушений лейкоцитарного фибринолиза у онкологических больных и в дальнейшем профилактика и лечение тромботических осложнений.

Для решения этой цели необходимо выполнить несколько задач: во-первых, дополнительно нагрузить нейтрофилы фибринолитиками для усиления их фибринолитической активности, во-вторых, повысить тропность нейтрофилов к фибрину, и, в-третьих, заставить нейтрофилы выбросить тромболитики в определенном месте при контакте с тромбом. В данной работе мы пытаемся решить лишь несколько из этих задач.

Материал и методы исследования

Исследования проводили на крови 21 здорового донора и 12 онкологических больных с раком желудка после хирургического вмешательства. Во всех экспериментах использовали нейтрофилы, выделенные из венозной гепаринизированной крови по стандартной методике на градиенте плотности фикол-верографин. Для определения фибринолитической активности клеток лейкоцитарную взвесь инкубировали на фибрине, после чего отбирали пробы супернатанта с последующим определением продуктов деградации фибрина иммуноферментным методом. Фибринолитическую активность клеток выражали в мкг продуктов деградации фибрина (ПДФ) в супернатанте [4]. Каждую взвесь нейтрофилов использовали в 4 сериях экспериментов.

Степень адгезии нейтрофилов к поверхности фибринового геля оценивали через 1 час инкубации клеточной суспензии в лунках плоскодонного полистеролового планшета. Накануне эксперимента лунки планшета покрывали слоем фибрина. Для этого в них вносили по 200 мкл смеси 1 % раствора фибриногена человека и раствор тромбина (активность 50 ед./мл) в соотношении 4:1. Сразу же после заполнения лунок содержимое вытряхивали и свертывание оставшегося количества смеси приводило к образованию тонкого слоя фибрина.

После удаления неприлипших клеток лунки отмывали культуральной средой. Затем проводили фиксацию метанолом (10 минут) и окрашивали по Романовскому [5]. Адгезивность клеток определяли при увеличении ×150 раз по их количеству в единице площади окулярной сетки микроскопа в 5 квадратах, установленных методом случайного отбора.

Полученные данные обработаны с помощью пакета статистических программ Statistica, версия 6,0, пакета программ Biostat и Microsoft Excel 2003 с расчетом статистически значимых различий (p).

Результаты исследованияи их обсуждение

На первом этапе мы попытались повысить фибринолитическую активность нейтрофилов. С этой целью мы использовали три группы веществ:

1. Фибринолитические ферменты (стрептаза, урокиназа).

2. Известные стимуляторы лейкоцитов (зимозан, продигиозан).

3. Прочие вещества (конкавалин А, хлористый аммоний).

Наибольшую стимулирующую активность на нейтрофилы оказывали фибринолитические ферменты.

Метод определения фибринолитической активности клеток предложен нами, поэтому вначале необходимо было определить наиболее оптимальные режимы. Нейтрофилы, выделенные из крови здоровых доноров, помещали в среду 199, содержащую стрептазу в различных концентрациях, определяли доза-эффект, а также инкубировали различные промежутки времени для определения время-эффекта. После тщательного отмывания в среде клетки наносили на фибриновые пластины для определения фибринолитической активности клеток. Контролем служили интактные нейтрофилы.

Установлено, что уже на первых минутах контакта клеток с ферментом их способность лизировать фибрин достоверно возрастает (табл. 1). Активация наивысшей степени наблюдается на 10 минуте инкубации. Максимально активирующей выявлена концентрация стрептазы 100 и 200 ед./мл среды.

Таким образом, увеличение тромботической активности нейтрофилов связано с накоплением фибринолитического препарата внутри клеток и сохранением его активности с возможностью дальнейшего выделения в окружающую среду.

Влияние преинкубации со стрептазой на фибринолитическую активность нейтрофилов (М ± m, n = 12)

Читайте также: