5 как осуществляют культивирование аэробных и анаэробных бактерий
Обновлено: 16.05.2024
Биологические особенности облигатных анаэробов обусловливают необходимость применения специальных методов их культивирования, отличающихся от используемых при работе с аэробными и факультативно-анаэробными микроорганизмами.
Важным условием, которое необходимо соблюдать на всех этапах выделения и идентификации анаэробов, является защита этих микроорганизмов от токсического действия молекулярного кислорода. Время между взятием материала и его посевом на питательные среды должно быть максимально коротким. Для защиты содержащихся в патологическом материале облигатных анаэробов от воздействия атмосферного кислорода используют специальные транспортные среды.
Анаэробные бактерии можно культивировать только на специальных бескислородных питательных средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом (10 – 150 мВ). Для контроля за степенью насыщения этих сред кислородом используют специальные редокс-индикаторы (метиленовый синий, резазурин), восстановленные формы которых бесцветны. При возрастании окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) метиленовый синий окрашивает среды в синий, а резазурин – в розовый цвет, что указывает на непригодность таких питательных сред для культивирования облигатных анаэробов.
Для сохранения низкого ОВП питательные среды должны быть агаризованы. Добавление даже 0,05 %-ного агара повышает их вязкость и уменьшает аэрацию. Для роста облигатно-анаэробных бактерий необходимо использовать только плотные свежеприготовленные питательные среды (не позднее двух часов после приготовления) или прередуцированные (выдержанные в анаэростате не менее суток). Для успешного выращивания анаэробов требуется внесение большого количества посевного материала, в связи с тем что большие концентрации облигатных анаэробов способны быстрее уменьшать ОВП среды и тем самым создавать благоприятные условия для своего роста.
Анаэробный тип дыхания во много раз менее продуктивен, чем аэробный, поэтому питательные среды для анаэробов должны быть более насыщены питательными субстратами и витаминами. В качестве питательной основы они содержат различные экстракты и белковые гидролизаты (сердечно-мозговой и печеночный настои, дрожжевой и соевый экстракты, пептон, триптон, гидролитический перевар казеина и др.), а также гемин, менадион, твин-80, сукцинат натрия, цельную или лизированную кровь. Для выделения различных анаэробов из смеси культур к питательным основам добавляют желчь, азид натрия, антибиотики, налидиксовую кислоту, малахитовый зеленый и другие ингредиенты. В лабораториях для выделения анаэробов из патологического материала чаще всего используют среду для контроля стерильности (СКС), СКС-199, среду Китта – Тароцци, анаэробный кровяной агар (на основе эритрит-агара или агара Д), среду Вильсона – Блера и некоторые другие с соответствующими добавками.
Необходимым условием культивирования анаэробных бактерий является создание анаэробных условий, что достигается с помощью физических, химических, биологических и смешанных методов.
1. Для удаления растворенного в питательных средах кислорода производят регенерацию этих сред путем кипячения в течение 15 – 20 мин на водяной бане. Затем среды быстро охлаждают до 45 – 50 °C.
После посева для предотвращения проникновения кислорода в жидкую питательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином.
2. Посев содержащего анаэробы патологического материала в высокий столбик плотной или полужидкой питательной среды, которая разливается в пробирки в объеме 10 – 12 мл. Кислород воздуха диффундирует обычно на расстояние 1,5 – 2,0 см от поверхности, а в глубине создаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов.
3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в удалении воздуха из герметически закрытых сосудов (анаэростатов, анаэробных боксов) с помощью вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом (азотом, аргоном, гелием) или бескислородной газовой смесью, состоящей из 80 % азота, 10 % двуокиси углерода и 10 % водорода. В ряде случаев используют природный (магистральный) газ. Для поглощения остатков кислорода из газовой смеси применяют палладиевый катализатор. Для поглощения водяных паров на дно анаэростата помещают хлористый кальций, силикагель или хлористый натрий.
1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде. Для поглощения кислорода используют смесь раствора пирогаллола и насыщенного раствора карбоната натрия (Nа2CO3).
2. Для поглощения кислорода из замкнутого пространства можно применять гидросульфит натрия.
3. Для связывания остатков кислорода в предназначенных для роста анаэробов питательных средах используют вещества-редуценты, к которым относятся тиогликолевая кислота или тиогликолат натрия, аскорбиновая кислота, различные сахара, цистин и цистеин, муравьинокислый натрий и др.
4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пластиковых пакетах).
Для образования водорода и двуокиси углерода, необходимых для роста облигатных анаэробов, используют специальные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород, генерируемый таблетками боргидрида натрия, связывает кислород воздуха в присутствии палладиевого катализатора с образованием воды. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия. Этот метод особенно удобен при работе в полевых условиях.
1. Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). На одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают исследуемый материал, а на другую – культуру аэробного или факультативно-анаэробного микроорганизма, способного энергично поглощать кислород. После посева чашку закрывают крышкой, края которой для герметизации заливают парафином или заклеивают пластилином. В качестве активного поглотителя кислорода из замкнутого пространства часто используют культуру Serratia marcescens, которая является своеобразным индикатором качества анаэробиоза. При недостаточной герметизации чашки этот микроорганизм образует ярко-красный пигмент, а при сохранении строго анаэробных условий вырастают бесцветные или бледно-розовые колонии.
2. Помещение в питательную среду кусочков печени, головного мозга, почек и других внутренних органов. При этом тканевые клетки активно поглощают и адсорбируют на себе кислород, в результате чего в среде создаются анаэробные условия. Примером питательной среды, сконструированной по этому принципу, является содержащая кусочки печени среда Китта – Тароцци. К тому же в печеночной ткани содержится большое количество веществ с SH-группой (цистеин, глютатион и др.), обладающих сильным редуцирующим действием.
В большинстве практических лабораторий применяют смешанные методы создания анаэробных условий. Для работы с наиболее чувствительными к молекулярному кислороду анаэробами используют строгую анаэробную технику (метод Хангейта). Метод основан на создании лишенных кислорода питательных сред, воздух над которыми удаляется и замещается бескислородным газом.
Для предотвращения попадания кислорода сосуды с питательными средами закрывают резиновыми пробками. Во время инокуляции анаэробиоз поддерживается за счет постоянного омывания сред потоком бескислородного газа.
Биологические особенности облигатных анаэробов обусловливают необходимость применения специальных методов их культивирования, отличающихся от используемых при работе с аэробными и факультативно-анаэробными микроорганизмами.
Важным условием, которое необходимо соблюдать на всех этапах выделения и идентификации анаэробов, является защита этих микроорганизмов от токсического действия молекулярного кислорода. Время между взятием материала и его посевом на питательные среды должно быть максимально коротким. Для защиты содержащихся в патологическом материале облигатных анаэробов от воздействия атмосферного кислорода используют специальные транспортные среды.
Анаэробные бактерии можно культивировать только на специальных бескислородных питательных средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом (10 – 150 мВ). Для контроля за степенью насыщения этих сред кислородом используют специальные редокс-индикаторы (метиленовый синий, резазурин), восстановленные формы которых бесцветны. При возрастании окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) метиленовый синий окрашивает среды в синий, а резазурин – в розовый цвет, что указывает на непригодность таких питательных сред для культивирования облигатных анаэробов.
Для сохранения низкого ОВП питательные среды должны быть агаризованы. Добавление даже 0,05 %-ного агара повышает их вязкость и уменьшает аэрацию. Для роста облигатно-анаэробных бактерий необходимо использовать только плотные свежеприготовленные питательные среды (не позднее двух часов после приготовления) или прередуцированные (выдержанные в анаэростате не менее суток). Для успешного выращивания анаэробов требуется внесение большого количества посевного материала, в связи с тем что большие концентрации облигатных анаэробов способны быстрее уменьшать ОВП среды и тем самым создавать благоприятные условия для своего роста.
Анаэробный тип дыхания во много раз менее продуктивен, чем аэробный, поэтому питательные среды для анаэробов должны быть более насыщены питательными субстратами и витаминами. В качестве питательной основы они содержат различные экстракты и белковые гидролизаты (сердечно-мозговой и печеночный настои, дрожжевой и соевый экстракты, пептон, триптон, гидролитический перевар казеина и др.), а также гемин, менадион, твин-80, сукцинат натрия, цельную или лизированную кровь. Для выделения различных анаэробов из смеси культур к питательным основам добавляют желчь, азид натрия, антибиотики, налидиксовую кислоту, малахитовый зеленый и другие ингредиенты. В лабораториях для выделения анаэробов из патологического материала чаще всего используют среду для контроля стерильности (СКС), СКС-199, среду Китта – Тароцци, анаэробный кровяной агар (на основе эритрит-агара или агара Д), среду Вильсона – Блера и некоторые другие с соответствующими добавками.
Необходимым условием культивирования анаэробных бактерий является создание анаэробных условий, что достигается с помощью физических, химических, биологических и смешанных методов.
1. Для удаления растворенного в питательных средах кислорода производят регенерацию этих сред путем кипячения в течение 15 – 20 мин на водяной бане. Затем среды быстро охлаждают до 45 – 50 °C.
После посева для предотвращения проникновения кислорода в жидкую питательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином.
2. Посев содержащего анаэробы патологического материала в высокий столбик плотной или полужидкой питательной среды, которая разливается в пробирки в объеме 10 – 12 мл. Кислород воздуха диффундирует обычно на расстояние 1,5 – 2,0 см от поверхности, а в глубине создаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов.
3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в удалении воздуха из герметически закрытых сосудов (анаэростатов, анаэробных боксов) с помощью вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом (азотом, аргоном, гелием) или бескислородной газовой смесью, состоящей из 80 % азота, 10 % двуокиси углерода и 10 % водорода. В ряде случаев используют природный (магистральный) газ. Для поглощения остатков кислорода из газовой смеси применяют палладиевый катализатор. Для поглощения водяных паров на дно анаэростата помещают хлористый кальций, силикагель или хлористый натрий.
1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде. Для поглощения кислорода используют смесь раствора пирогаллола и насыщенного раствора карбоната натрия (Nа2CO3).
2. Для поглощения кислорода из замкнутого пространства можно применять гидросульфит натрия.
3. Для связывания остатков кислорода в предназначенных для роста анаэробов питательных средах используют вещества-редуценты, к которым относятся тиогликолевая кислота или тиогликолат натрия, аскорбиновая кислота, различные сахара, цистин и цистеин, муравьинокислый натрий и др.
4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пластиковых пакетах).
Для образования водорода и двуокиси углерода, необходимых для роста облигатных анаэробов, используют специальные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород, генерируемый таблетками боргидрида натрия, связывает кислород воздуха в присутствии палладиевого катализатора с образованием воды. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия. Этот метод особенно удобен при работе в полевых условиях.
1. Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). На одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают исследуемый материал, а на другую – культуру аэробного или факультативно-анаэробного микроорганизма, способного энергично поглощать кислород. После посева чашку закрывают крышкой, края которой для герметизации заливают парафином или заклеивают пластилином. В качестве активного поглотителя кислорода из замкнутого пространства часто используют культуру Serratia marcescens, которая является своеобразным индикатором качества анаэробиоза. При недостаточной герметизации чашки этот микроорганизм образует ярко-красный пигмент, а при сохранении строго анаэробных условий вырастают бесцветные или бледно-розовые колонии.
2. Помещение в питательную среду кусочков печени, головного мозга, почек и других внутренних органов. При этом тканевые клетки активно поглощают и адсорбируют на себе кислород, в результате чего в среде создаются анаэробные условия. Примером питательной среды, сконструированной по этому принципу, является содержащая кусочки печени среда Китта – Тароцци. К тому же в печеночной ткани содержится большое количество веществ с SH-группой (цистеин, глютатион и др.), обладающих сильным редуцирующим действием.
В большинстве практических лабораторий применяют смешанные методы создания анаэробных условий. Для работы с наиболее чувствительными к молекулярному кислороду анаэробами используют строгую анаэробную технику (метод Хангейта). Метод основан на создании лишенных кислорода питательных сред, воздух над которыми удаляется и замещается бескислородным газом.
Для предотвращения попадания кислорода сосуды с питательными средами закрывают резиновыми пробками. Во время инокуляции анаэробиоз поддерживается за счет постоянного омывания сред потоком бескислородного газа.
Ферментация как совокупность процессов, результатом которых является культуральная жидкость, условия протекания данного процесса: аэробные и анаэробные. Конструкции ферментеров, разработанные для каждого вида процесса ферментации, принцип их работы.
| Рубрика | Химия |
| Вид | реферат |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 03.06.2015 |
| Размер файла | 340,9 K |
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Аэробные и анаэробные биореакторы
Технологическое оформление процессов промышленной биотехнологии в значительной мере определяется отношением микроорганизма-продуцента к кислороду. При использовании аэробных культур ферментационное оборудование и нормы технологического режима подбираются таким образом, чтобы массообмен (перенос кислорода из газовой в жидкую фазу) обеспечивал поступление кислорода к клеткам в количествах, необходимых и оптимальных для данной культуры в данной фазе роста.
Промышленное использование факультативных анаэробов не ставит задачи абсолютного исключения кислорода из среды, поэтому процессы этого типа (брожение) технологически проще аэробных. В начальной фазе этих процессов требуется лишь удалить кислород из газовой фазы над культуральной жидкостью, что может быть достигнуто введением инертного газа или просто вытеснением воздуха углекислотой, выделяемой клетками при метаболизме.
Технологическое оформление строго анаэробных процессов сложнее, чем для процессов брожения, так как в этом случае необходимо полностью исключить возможность попадания кислорода в газовую, а оттуда и в жидкую среду. В процессе приготовления ферментированных кормов одной из стадий является первичная ферментация, в результате которой получают, в так называемых первичных ферментерах, жидкую рабочую закваску.
1. Классификация способов ферментации и ферментеров
Ферментация - это совокупность процессов, результатом которых является культуральная жидкость [6].
Ферментация (культивирование) может протекать как в аэробных, так и в анаэробных условиях (рис. 1).
Рисунок 1 - Классификация процессов ферментации
Аэробное культивирование применяют в тех случаях, когда в процессе задействованы аэробные микроорганизмы-продуценты. Аэрацию смеси осуществляют подачей воздуха или других газов через газоподводящие трубки, форсунки и т.д.
Анаэробные процессы протекают в герметичных емкостях либо посредством продувания культивируемой среды инертными газами. Конструкция ферментера при анаэробной ферментации проще, чем при аэробной [4].
Анаэробный ферментер - anaerobic digester, anaerobic reactor - биореактор, предназначенный для оптимизации анаэробной ферментации; широко используется для обработки отходов с высоким содержанием твёрдых веществ, например навоза, городских стоков и др.
Аэробный ферментер - aerobic reactor - биореактор, обеспеченный системой аэрации для культуры аэробных организмов.
Рисунок 2 - Классификация ферментеров
Для каждого вида процесса ферментации разработаны различные конструкции ферментеров (рис. 2).
Так, например, разработаны аппараты аэробной поверхностной ферментации, которые широко применяются для производства органических кислот. Поверхностная жидкофазная ферментация протекает в бродильных вентилируемых камерах с размещенными на стеллажах кюветами. В таких же камерах, но с размещенными на стеллажах лотками, в которые насыпают сыпучую твердую среду слоем 10…15 мм, проводят твердофазную ферментацию. С целью лучшей аэрации среды днище лотков выполнено перфорированным [6].
C целью интенсификации массо- и энергообмена клеток со средой разработаны аппараты аэробной глубинной ферментации. Но эти аппараты имеют более сложную конструкцию. С точки зрения конструктивных особенностей ферментеры различаются способами подвода энергии и аэрации среды [6]:
ферментеры с подводом энергии к газовой фазе;
ферментеры с подводом энергии к жидкой фазе;
ферментеры с комбинированным подводом энергии (рис. 2).
В ферментерах с подводом энергии к газовой фазе аэрация и перемешивание субстрата происходит сжатым воздухом.
К таким аппаратам относятся:
барботажные ферментеры. Подача воздуха в них осуществляется через барботажные устройства, которые расположены в нижней части аппарата;
аппараты с диффузором. Смешивание субстрата с воздухом, который поступает по распределительным трубам, в данных ферментерах происходит в нижней части аппарата посредством внутреннего цилиндр-диффузора;
трубчатые ферментеры. Под действием потока воздуха жидкость циркулирует по реактору и сепаратору;
ферментеры с форсуночным распределением воздуха. Воздух в таких ферментерах подается через форсунки, расположенные в нижней части аппаратов;
ферментеры колонного типа выполнены в виде цилиндрической колонны, которая разделена горизонтальными перегородками на несколько секций. В таких устройствах воздух барботирует через слой жидкости каждой тарелки, за счет движения жидкости через кольцевую щель обеспечивается противоточное движение двух фаз - газовой и жидкой.
К ферментерам с подводом энергии к жидкой фазе относятся:
аппараты с самовсасывающей турбиной состоят из цилиндрического диффузора и мешалки с полыми лопастями и валом. При вращении мешалки создается разрежение, которое приводит к подъему жидкости в кольцевом зазоре между диффузором и стенками аппарата с последующим ее возвращением в диффузор;
ферментер с турбоэжекторными перемешивающими устройствами. Эти устройства разделены вертикальными перегородками на несколько секций. В каждой секции имеется эжектор и диффузор. Перемещение жидкости из одной секции в другую происходит через окна в перегородках.
Ферментеры с комбинированным подводом энергии представляют собой цилиндрический сосуд, внутри которого расположена механическая мешалка и барботер. В аппаратах этого типа подвод энергии к газовой фазе осуществлен для аэрации, а к жидкой фазе - для перемешивания. Перемешивание в данных ферментерах осуществляется тремя способами.
Аппараты с механическим перемешиванием снабжены механической мешалкой. Аэрация осуществляется путем барботажа. С целью разбрызгивания воздуха рядом с барботером установлен механический вибратор.
Аппараты с пневматическим перемешиванием. Перемешивание и аэрацию усиливают с помощью вращающихся дисков с отверстиями или придонных пропеллеров. Такие аппараты могут быть также дополнены диффузором.
В аппаратах с циркуляционным перемешиванием жидкость циркулирует по замкнутому контуру. Движение субстрату придает насос или другое аналогичное устройство. Ферментеры выполнены в виде цилиндра.
2. Устройство ферментера
Обычно ферментер изготавливают из высококачественной нержавеющей стали, так что он не подвержен коррозии и не выделяет в среду токсичные соли металлов. Все используемое оборудование, материалы и воздух должны быть стерильными. Оборудование стерилизуют паром под давлением. Пар должен иметь доступ ко всем поверхностям, которые в свою очередь должны быть гладкими и отполированными, насколько это возможно, и не иметь трещин и неровностей, в которых могут скапливаться микроорганизмы. Среду стерилизуют перед инокуляцией, пропуская пар через систему охлаждения. Воздух стерилизуют путем фильтрации (рис. 3).
3. Принцип действия, схема
Аэробное культивирование - аэрация среды - непременное условие в тех микробиологических процессах, в которых используются аэробные микроорганизмы-продуценты.
Потребность аэробных микроорганизмов в молекулярном кислороде зависит от окисляемого источника углерода и от физиологических свойств и активности роста микроорганизмов. Для биосинтеза 1 кг дрожжевой биомассы необходимо, например, 0,74-2,6 кг молекулярного кислорода. При интенсивном потреблении субстрата независимо от источника углерода продуцент ассимилирует 0,83-4,0 мг кислорода/1 л среды/мин.
Растворимость кислорода в среде сравнительно низка и зависит от температуры, давления и от концентрации растворенных, эмульгированных и диспергированных компонентов. При давлении 0,1 МПа и температуре 30°С в 1 л дистиллированной воды максимальное количество растворенного кислорода составляет 7,5 мг. В реальной питательной среде максимальная растворимость кислорода колеблется в интервале 2-5 мг/л. Запасы кислорода в среде обеспечивают жизнедеятельность аэробного продуцента в течение 0,5-2 мин.
При глубинном культивировании запасы кислорода в питательной среде возобновляются при подаче аэрирующего воздуха. Скорость абсорбции кислорода увеличивается с ростом интенсивности перемешивания среды.
Во время роста биомассы микроорганизмы обычно потребляют больше кислорода, чем во время сверхсинтеза целевого метаболита. Принято говорить о критической концентрации кислорода, при которой наблюдается лимитация дыхания клеток. Для большинства аэробных микроорганизмов, растущих в сахаросодержащих субстратах, критическая концентрация кислорода 0,05-0,10 мг/л, что соответствует 3-8% от полного насыщения среды кислородом. Лимитация роста и физиологической деятельности клеток наблюдается при более высоких концентрациях кислорода: на средах с глюкозой рост дрожжей лимитируется при рО2 на уровне 20-25% от полного насыщения.
Оптимальной для роста биомассы считается концентрация кислорода 50-60% от полного насыщения, для биосинтеза целевых метаболитов - 10-20%.
Анаэробные процессы биологического окисления у гетеротрофных микроорганизмов в зависимости от того, что является конечным акцептором водородных атомов или электронов, делят на три группы: дыхание (акцептор - кислород); брожение (акцептор - органическое вещество) и анаэробное дыхание (акцептор - неорганическое веществ: нитраты, сульфаты и др.).
У облигатных анаэробов брожение является единственно возможным способом получения энергии; у факультативных анаэробов оно составляет обязательную первую стадию катаболизма глюкозы, за которой может следовать аэробное окисление образовавшихся продуктов, если в среде присутствует кислород.
Примерами облигатно анаэробных процессов являются маслянокислое и метановое брожения. Универсальным для всех микроорганизмов, за небольшими исключениями, является катаболизм глюкозы - гликолиз до образования пирувата:
Глюкоза + 2АТР + 2 NAD = 2 Пируват + 4АТР + 2NADH + 2Н+
Возбудители спиртового брожения (дрожжи) после декарбоксилирования пирувата и образования ацетальдегида восстанавливают ацетальдегид до этанола. Молочнокислые бактерии гомогенного молочнокислого брожения восстанавливают пируват до молочной кислоты. Гетероферментативные молочнокислые бактерии сбраживают глюкозу по несколько отличающемуся пентозофосфатному пути с образованием молочной кислоты, а также уксусной кислоты, этанола и диоксида углерода.
Анаэробные условия на производстве создают герметизацией аппаратуры, продуванием среды инертными газами, в том числе газообразными продуктами, образовавшимися во время ферментации. Отсутствие необходимости аэрации среды несколько упрощает при анаэробной ферментации конструкцию ферментера (биореактора) и облегчает управление процессом.
4. Эксплуатация, применение
Глубинное культивирование аэробных микроорганизмов используется в промышленности для выращивания обогащенной белком биомассы клеток, используемой, например, в качестве кормовых добавок к рациону животных и птиц, а также при последующем получении аминокислот, витаминов и других биологически активных веществ. Такие процессы создают возможности получения целевых продуктов с помощью доступных и возобновляемых ресурсов при достаточно низком энергопотреблении [10].
Традиционное выращивание дрожжей в спиртовом производстве осуществляется в анаэробных условиях при относительно низких скоростях роста и повышенном удельном расходе субстрата. Расход субстрата на дрожжегенерацию при этом составляет до 5% всех сбраживаемых Сахаров, содержащихся в среде. Анаэробное культивирование дрожжей осуществляют поэтапно путем их размножения во всевозрастающих количествах сусла и пересевом активно бродящих дрожжей из меньших объемов в большие [1].
Предприятия агропромышленного комплекса и пищевой промышленности являются источниками мощного антропогенного воздействия на экосистемы и окружающую среду. Среди этих органических загрязнений особо выделяются в качестве наиболее крупнотоннажных - отходы животноводства, а именно навоз крупного рогатого скота и свиней, а в качестве наиболее экологически опасных - жидкий куриный помет.
Животноводческие предприятия постоянно сталкиваются с проблемой утилизации и переработки больших масс экскрементов. Существующие мероприятия по утилизации биологических отходов характеризуются значительными капитальными затратами и требуют существенных трудовых и энергетических затрат [2, 3].
Жидкие отходы обладают большей влажностью, высокой биологической активностью, содержат значительное количество бактерий, в том числе патогенных, всхожих семян сорняков, поэтому их переработка традиционными методами связана с большими затратами.
Одной из наиболее эффективных современных энерго- и ресурсосберегающих технологий переработки органических отходов является технология их метаногенного сбраживания с получением биогаза.
Эта технология имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными способами компостирования и аэробной обработки:
При аэробной очистке отходов образуется избыточный активный ил, в который переходит до 50% всей энергии исходного органического вещества, тогда как в анаэробных процессах до 90-95% всей энергии субстрата аккумулируется в виде биогаза (метана) с энергетической ценностью (2,2 - 2,7) * 10 7 Дж * м -3 , что делает его энергоносителем, пригодным для использования с получением электроэнергии и тепла [9].
Таким образом, отходы сельского хозяйства и особенно животноводства способны внести заметный вклад в структуру энергопроизводства на федеральном и региональном уровне [8, 11]. Требует внимания также вопрос рационального использования жидких отходов и сточных вод пищевой и перерабатывающей промышленности [5, 7].
Тип ферментера (биореактора) для каждого биотехнологического процесса выбирают с учетом специфики продуцента, свойств среды и экономических соображений. Важное значение для аэробного процесса имеет система аэрации. При этом оценивают, с одной стороны, скорости поступления кислорода с жидкостью и его массопередачи от газовой фазы, с другой - скорости потребления кислорода микроорганизмами и его удаления с отработавшей жидкостью.
Список использованной литературы
1. Александровская Ю.П. Аэробное культивирование спиртовых дрожжей в биореакторе с мембранным аэрирующим устройством / дисс. канд. техн. наук. - Казань, 2004. - 173 с.
2. Биркин С.М., Антонов Н.М. Совершенствование схемы анаэробной переработки отходов животноводства / Вестник КрасГАУ. - 2009. - №4. - С. 197-202.
3. Животноводческие комплексы и охрана окружающей среды / Ю.И. Ворошилов, С.Д. Дурдыбаем, Л.Н. Елбанова [и др.]. - М.: Агропромиздат, 1991. - 107 с.
4. Свистунов А.И. Классификация способов ферментации и ферментеров / Вестник НГИЭИ. - 2013. - №10 (29). - с. 109-114.
5. Сироткин А.С. Биосорбционные технологии очистки сточных вод / А.С. Сироткин [и др.] // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2010. - №6. - С. 65-75.
8. Хабибуллин Р.Э., Шарифуллин В.Н. Исследование процесса анаэробного сбраживания куриного помета и инженерная методика технологического расчета биореактора / Вестник Казан. технол. ун-та. - 2010. - №9. - С. 639-646.
9. Харитонова Л.Ю. Закономерности процесса культивирования аэробных микроорганизмов в одно- и двухсекционном биореакторе / дисс. канд. техн. наук. - Москва, 2003. - 184 с.
10. Холин К.В. Физико-химический и биохимический анализ биогазовых субстратов и их практическая значимость / К.В. Холин [и др.] // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2010. №2. С. 457-464.
Подобные документы
Технологические операции, из которых состоит жидкостная экстракция. Устройство ящичного экстрактора. Движущая сила процесса экстракции в системе "твёрдое тело-жидкость". Теоретические основы экстрагирования из лекарственного растительного сырья.
курсовая работа [1,9 M], добавлен 20.11.2013
Общие сведения о процессе экстракционного разделения, область его применения. Основные схемы проведения экстракционных процессов. Равновесие в системе жидкость-жидкость. Основные группы промышленных экстрагентов. Материальный баланс процесса экстракции.
контрольная работа [165,2 K], добавлен 15.10.2011
Уравнение химической реакции с использованием электронно-ионного метода. Определение потенциалов окислителя и восстановителя, направления протекания процесса, термодинамических характеристик H,S,G. Электронная формула элементов по 2 и 4 квантовым числам.
курсовая работа [22,5 K], добавлен 25.11.2009
Реакция осаждения, результатом которой является образование малорастворимого соединения – седиметрия. Критерии седиметрии. Реакции серебра как наиболее соответствующие седиметрии. Совокупность методов – аргентометрия. Способы индикации конца титрования.
реферат [23,9 K], добавлен 23.01.2009
Исследование роли лимонной кислоты в системе биохимических реакций клеточного дыхания организмов. Основное сырье и способы производства лимонной кислоты. Характеристика особенностей поверхностного и глубинного способов ферментации сахарсодержащих сред.
курсовая работа [1,1 M], добавлен 06.01.2014
Изучение сути экстракции - процесса извлечения одного или нескольких компонентов из растворов или твердых тел с помощью избирательно действующих растворителей. Органические растворители, применяемые при этом. Катионообменная и анионообменная экстракция.
курсовая работа [1,2 M], добавлен 30.10.2011
Суть перегонки жидкостей - процесса, в котором разделяемая жидкая смесь нагревается до кипения, а образующийся пар отбирается и конденсируется. Равновесие в системе пар-жидкость. Закон Рауля. Материальный баланс непрерывной ректификации бинарных смесей.
Свидетельство и скидка на обучение каждому участнику
Методы выделение чистых культур микроорганизмов аэробов и анаэробов.
1. Методы выделения аэробов. Бактериологический метод: назначение, цель, этапы
2. Методы выделения анаэробов
1.Бактериологический (культуральный) метод — комплекс методов для выявления патогенных микроорганизмов у больного, у носителя или на объектах внешней среды. Это метод выделения, выращивания и определения свойств чистой культуры микроорганизмов с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их идентификация. Выделение чистой культуры основа бактериологического метода.
Чистая культура — микроорганизмы одного вида, полученные из одной или нескольких клеток в результате размножения на искусственной питательной среде. Бактериологическое исследование может быть использовано для диагностики, профилактики инфекционных заболеваний, для санитарно-гигиенической характеристики среды, окружающей человека, для научного исследования. Материал и метод бактериологического исследования зависят от цели анализа, условий среды, патогенеза и течения заболевания. В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование.
Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:
1-й день (I этап). - Основная цель этого дня – произвести посев исследуемого материала таким способом и методом, чтобы получить рост изолированных колоний.
1. Макроскопическая оценка исследуемого материала (объём, цвет, характер, консистенция). От этой оценки зависит подготовка материала к посеву и выбор сред. Механический метод выделения чистой культуры используют если: Материала много и он жидкий (моча, СМЖ), то материал центрифугируют и для посева используют осадок, предварительно слив надосадочную жидкость, таким образом, посевной материал содержит все микроорганизмы исследуемого материала. Если материал вязкий ( гной, мокрота, фекалии), то небольшую порцию материала растирают со стерильным физ. раствором и полученную эмульсию используют для посева. Если материал плотный (кусочки ткани или кости), то с них делают смыв стерильным физ. раствором и засевают на среды смывы.
Физический метод используют, если исследуемый материал по направлению предполагает наличие споровых культур, в таком случае часть или весь материал прогревают до + 800С, при этом сопутствующая вегетативная флора погибает, а сохранившиеся споры после посева прорастают и дают чистую культуру возбудителя.
Химический метод используют, если материал может предполагать наличие кислотоустойчивых бактерий, то в этом случае порцию материала обрабатывают 2-4 % раствором H2SO4, а затем нейтрализуют щёлочью под контролем индикатора и используют для посева. При такой обработке погибает вся сопутствующая флора, сохраняются только кислотоустойчивые бактерии. Соответственно поступают и при наличии щёлоче- и спиртоустойчивых бактерий.
Биологический метод . К этому методу относят добавление в питательную среду антибиотика, к которому устойчив предполагаемый возбудитель, этом случае гибнет под воздействием данного антибиотика вся сопутствующая флора в исследуемом материале. Также к биологическому методу относят заражение исследуемым материалом лабораторных животных, чувствительных к данному возбудителю, после чего у животного берут материал и высевают на питательные среды.
Метод элективных сред позволяет выделить определённого возбудителя, за счет нахождения в питательной среде элективного фактора к которому чувствительна сопутствующая флора.
2. В некоторых случаях проводят микроскопию мазка из исследуемого материала, окрашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой и ориентировочного ответа, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева.
3. Если в исследуемом материале заведомо мало выделяемого возбудителя, то такой материал засевают на среды обогащения, в этом случае бактериологическое исследование длиться дольше на один или несколько дней.
4.Затем посев материала на питательные среды для получения изолированных колоний. Среды подбирают также исходя из особенностей предполагаемого возбудителя и характера материала.
Способ посева может быть открытым или закрытым, что зависит от возможности предполагаемого возбудителя находиться в воздухе. Для того чтобы получить рост изолированных колоний можно использовать методы посева, выполненные с помощью бак. петли, шпателя, стеклянной палочки и ватного тампона:
А.Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют оставшуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на третьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наименьшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изолированные колонии.
Б.Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на одной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора - метод посева по секторам. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, делая посевную площадку, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из первого сектора во 27 второй и таким же образом последовательно в третий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после суточного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.
Посев по секторам с посевной площадкой. Посев по секторам можно произвести и без посевной площадки. Начав с первого сектора без прокаливания петли произвести посев последовательно во втором, третьем и четвёртом секторах
В. Можно использовать и другие техники посева. Например, посев бактериологической петлёй штрихами или зигзагообразно по всей поверхности чашки Петри. Для этого исследуемый материал набирают стерильной петлей и втирают в поверхность среды возле края чашки.
После этого петлю стерилизуют в пламени, чтобы уничтожить избыток материала, охлаждают. Следующий этап посева начинают с места, где закончился предыдущий. Петлю кладут горизонтально на поверхность агара, где было сделана посевная площадка, проводят один-два раза по поверхности и делают штрихи по остальной среде. Необходимо пытаться, чтобы штрихи посева длились от края к краю чашки, не повреждали поверхности агара и располагались близко друг к другу. Этим искусственно продлевается линия посева и создаются возможности для получения изолированных колоний
Посев шпателем и тампоном в чашки Петри. Материал предварительно наносят на поверхность питательной среды возле края чашки петлей или пипеткой. Стерильный шпатель проносят через пламя, охлаждают, касаясь стенки чашки. Осторожными круговыми движениями распределяют материал равномерно по поверхности среды.
2-й день (II этап). Начинают данный этап с изучения культуральных свойств полученных колоний. На основании изучения этих характеристик, выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отбирают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью изучения морфологических и тинкториальных свойств и проверки однородности микробов в колонии (приготовление мазка, окраска по Граму). Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным питательным агаром с целью накопления чистой культуры. Пробирку инкубируют в термостате 24 часа при температуре 37° С.
Т ехника посева в пробирки со скошенной средой : На скошенные среды переносят культуру из другой пробирки или с колоний на чашках. Прокалённой петлёй берут часть необходимой колонии с чашки Петри, чашку закрывают и отставляют. Пробирку держат в левой руке наклонном положении между большим и указательным пальцами так, чтобы поверхность среды можно было наблюдать. Петля - в правой руке. Пробку пробирки вынимают, зажимая их между мизинцем и ладонью. В таком положении она остаётся до конца посева. Край пробирки обжигают, переносят петлю, не прикасаясь к стенкам, в 29 пробирку и делают сплошной штриховой посев. Петлю прокаливают, ставят в штатив, край пробирки прокаливают и закрывают пробкой. Техника посева в конденсационную воду: выбирают свежескошенную среду, содержащую на дне каплю конденсационной жидкости. Исследуемую культуру забирают петлей, открывают пробку, обжигают края пробирки, осторожно, не касаясь среды и стенок, вносят в конденсационную воду петлю с культурой. У выраженных подвижных культур рост с конденсационной воды распространяется на влажную поверхность косяка.
3-й день (III этап).
1.Описывают культуральные свойства накопленной чистой культуры.
2.Проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка ( мазок окрашивают по Граму, в мазке должны быть однородные по морфологическим признакам и тинкториальным свойствам клетки). При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным.
3. Идентификация выделенной культуры проводится по: - биохимическим свойствам. Среды Гисса дифференциально-диагностические питательные среды для выявления ферментативной активности бактерий. Содержат 1% пептонную воду, 0,5% раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, манит, сахароза и др.) и индикатор Андреде (кислый фуксин в растворе NaOH). Среда при рН 7,2-7,4 – бесцветна, при ферментации углеводов приобретает красный цвет. В пробирки со средой помещают поплавок (небольшая трубочка, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при расщеплении углеводов.
чувсвительности к антибиотикам.
- антигенным свойствам - фагочувствительности - токсигенности и другим признакам. Фаготипирование по методу Фишера. Испытуемую культуру засевают на МПА, затем условно делят чашку на квадраты. В каждый квадрат наносят по одной капле различных фагов. После суточной инкубации в термостате отмечают квадраты, в которых отмечается лизис бактерий. Фаготип бактериальной культуры определяется типом лизирующего ее фага
Фагоидентификация по методу Отто. На чашку с МПА шпателем или петлёй выполняется посев выделенной культуры бактерий. Затем наносят каплю известного бактериофага и, наклонив чашку, дают капле несколько растечься по поверхности питательной среды. Через сутки наблюдают полную задержку роста в месте внесения диагностического фага.
4. Посевы инкубируют в термостате 24 часа при температуре 37° С. 4-й день (IV этап). Учет результатов и выдача ответа
2.Методы выделения анаэробов
Анаэробы растут и размножаются в условиях, исключающих доступ кислорода воздуха. Молекулярный кислород оказывает на них токсическое действие. Необходимую для существования энергию анаэробы получают путем расщепления органических и неорганических соединений, входящих в состав питательной среды. Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные условия, сущность которых заключается в удалении молекулярного кислорода из питательной среды и пространства, окружающего эти культуры. Другим обязательным условием, обеспечивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду. А также условием может быть и режим инкубации – посевы со многими анаэробными культурами выдерживают в термостате при 420С 2-3 суток. Удаление кислорода из питательной среды.
Единственным отличием питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, служит пониженное содержание в них свободного кислорода. Самым простым способом удаления растворенного кислорода является кипячение. Непосредственно перед посевом материала пробирки с питательными средами кипятят в водяной бане в течение 10—20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, удаляется кислород. Свежепрокипяченную питательную среду быстро охлаждают, погружая в лед или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воздуха, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху стерильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1—1,5 см). Засев среды производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки. Можно использовать вещества, связывающие кислород. В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, аскорбиновую кислоту, цистеин, глютатион. Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов. На этом свойстве животных клеток основано приготовление питательной среды Китта—Тароцци, широко применяемой для выращивания анаэробов. В жидкие питательные среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха.
Удаление кислорода из окружающего пространства. Для создания бескислородных условий используют физические, химические и биологические факторы.
Физические способы культивирования анаэробов.
1 .Способ Виньяля - Вейона. Берут 4-5 пробирок с 0,5% расплавленным и охлажденным до температуры 40-45 °С сахарным агаром. В содержимое одной из них вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала (1 мл.) и тщательно размешивают. Для уменьшения концентрации материала с целью получения изолированных колоний засеянную среду в количестве, соответствующем объему внесенного материала, переносят из 1-й пробирки во 2-ю, из 2-й в 3-ю. Затем содержимым каждой пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. Чтобы предупредить застывание питательной среды в момент насасывания ее в пипетки, кончик их, пока он не обломан, погружают на 3-5 минут в стерильную воду температуры 45-50°С. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают на спиртовке, а широкий заливают парафином и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изолировать. Для этого капилляр надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микроба, находящуюся в агаре, извлекают петлей и пересевают в свежую питательную среду.
2 . Метод Перетца —
3. Выращивание анаэробов в условиях вакуума . Вакуумные условия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Исследуемый материал или культуру микробов засевают в пробирки с жидкой средой или в чашки Петри с плотной питательной средой. Посевы помещают в анаэростат, который представляет собой толстостенный металлический (пластиковый, стеклянный) цилиндр с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана, затем присоединяют его к насосу и выкачивают воздух. Степень разреженности воздуха определяют по показаниям вакуумметра. Колонии анаэробов в вакуумных условиях растут на поверхности плотной питательной среды. Можно создать бескислородные условия при помощи эксикатора, если эксикатор с краном, то по тому же принципу откачивается воздух, как и в анаэростате. Если эксикатор без крана, то в этом случае чашки с посевами кладут внутрь, ставят свечу и её зажигают, затем плотно притирают крышку. Пламя свечи выжгет весь кислород в эксикаторе и погаснет, таким образом, внутри эксикатора создадутся бескислородные условия.
Химические способы культивирования анаэробов.
Способ Аристовского. Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидросульфит натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор помещают в термостат при температуре 37 °С на 24 - 48 ч.
Биологический метод выращивания анаэробов.
Способ Фортнера. В чашку Петри наливают толстым слоем сахарный агар. Посередине чашки в питательной среде вырезают стерильным скальпелем канавку шириной 1—1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом, другую половину - культурой аэробов: чудесной палочкой (Serratia marcescens) или кишечной палочкой (Е. coli). Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы аэробы вместе с капельками влаги - не могли попасть на другую сторону чашки. Чашка закрывается, ее края запаиваются парафином (с целью не допустить попадания воздуха внутрь чашки). . В термостате чашки устанавливают вверх дном. Сначала вырастают в присутствии кислорода аэробы, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов.
Питательные среды для выращивания анаэробов .
1. Среда Китта-Тароцци. обеспечивает рост многих спорообразующих и строгих аспорогенных анаэробов. Состоит из питательного бульона, 2% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 10-15 минут для удаления воздуха. После посева среду заливают небольшим слоем вазелинового масла. Выросшие анаэробы вызывают помутнение питательной среды.
2. Среда Вильсона-Блер а (железо-сульфитный агар) используется для выделения анаэробных бактерий. Готовится из питательного агара, к которому добавляют 1% глюкозу, хлорид железа и сульфит натрия. Анаэробы образуют на среде колонии черного цвета за счет образования соединений железа с серой. Посев можно делать на поверхность среды, налитой в чашку Петри, а также в расплавленную среду в пробирке (рост в виде черных прожилок).
3.Среда Цейсслера - сахарный агар с кровью для выращивания и дифференциации анаэробов. Готовится следующим образом: к обычному мясопептонному агару добавляют 1- 2% глюкозу (рН среды =7,2—7,4) и стерилизуют в автоклаве при температуре 112° 20 минут. К 100 мл расплавленного, охлажденного до 45° агара добавляют 10 - 15 мл стерильно взятой дефебрилированной человеческой, лошадиной или бараньей крови, тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Перед использованием чашки следует выдерживать сутки при комнатной температуре. В основу определения вида анаэробов положена форма роста их на среде Цейсслера в анаэробных условиях.
4. Молоко по Тукаеву . К 1% пептонной воде прибавляют 5-6% обезжиренного молока, среду стерилизуют дробно при 1000C 3 дня подряд по 30 мин. Анаэробы дают рост в виде белого сгустка и просветления над ним среды. 5. 1% сахарный агар. Мясо-пептонный агар с добавлением 1% раствора глюкозы, стерилизуют в автоклаве при температуре 112° 20 минут, разливают в пробирки и в чашки Петри. Посев делают чаще в расплавленную среду, где анаэробы в толще среды дают колонии разнообразной формы .
Читайте также: