Перхлоратный метод выделения днк протокол

Обновлено: 04.07.2024

Институт криминалистики Центра специальной техники ФСБ России, Москва

Сравнение эффективности выделения ДНК из ногтевых пластин с помощью коммерческих наборов реагентов

Журнал: Судебно-медицинская экспертиза. 2013;56(4): 27-29

Деревягина Е. О., Куклев М. Ю., Лапенков М. И., Плахина Н. В. Сравнение эффективности выделения ДНК из ногтевых пластин с помощью коммерческих наборов реагентов. Судебно-медицинская экспертиза. 2013;56(4):27-29.
Dereviagina E O, Kuklev M Iu, Lapenkov M I, Plakhina N V. Comparison of the effectiveness of DNA isolation from nail plates with the use of commercial kits. Sudebno-Meditsinskaya Ekspertisa. 2013;56(4):27-29.

Институт криминалистики Центра специальной техники ФСБ России, Москва

Исследовали эффективность выделения ДНК из ногтевых пластинок с использованием трех наборов реагентов различных производителей. По итогам исследования для работы с микрофрагментами ногтей можно рекомендовать наборы PrepFiler BTA Forensic DNA Extraction Kits и QIAamp DNA Investigator Kit.

Институт криминалистики Центра специальной техники ФСБ России, Москва

Ногтевые пластины являются придатком кожи. Они образованы плотно прилегающими друг к другу роговыми чешуйками, заполненными белком кератином. Ногтевые пластины и их срезы содержат достаточное количество генетического материала и более устойчивы к разложению, чем мягкие ткани. С учетом этого ногтевые пластины используют как объект судебно-медицинской экспертизы при идентификации неопознанных лиц, а фрагменты ногтей могут быть исследованы в качестве биологического следа предполагаемого преступника при проведении судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств [1—3]. Первоначально для выделения ДНК из ногтей использовали метод фенолхлороформной экстракции с последующей очисткой и концентрированием препарата ДНК [1]. Это многостадийный, трудоемкий и длительный процесс, связанный с использованием токсичных реагентов и сопровождающийся большими потерями ДНК [4]. В настоящее время разработаны более эффективные и удобные способы выделения ДНК, позволяющие в большинстве случаев отказаться от фенольного метода.

Цель исследования — изучение возможности применения коммерческих наборов для выделения ДНК при анализе срезов ногтевых пластин, а также их сравнение с целью выявления оптимального подхода при исследовании малых количеств ногтей в рамках молекулярно-генетических экспертиз.

При использовании первых двух наборов ДНК сорбируют на магнитных частицах, а 1 /₃ его — на мембране колонок.

Материал и методы

Исследуемые образцы

1. Фрагменты ногтевых пластин длиной от 2 до 10 мм от 33 лиц мужского и женского пола. Навески подготовленного материала составляли от 0,9 до 15,6 мг.

2. Ногтевая пластина трупа, мягкие ткани которого находились в значительной степени разложения.

Срезы ногтевых пластин очищали скальпелем от загрязнений, в том числе от подногтевого содержимого, затем отмывали последовательно в деионизированной воде и 96% этиловом спирте и сушили на воздухе. Для выделения по протоколам №1 и №2 (см. Выделение ДНК) ногти тщательно измельчали скальпелем путем послойного расщепления на тонкие фрагменты. Для выделения по протоколу №3 ногти нарезали на фрагменты с помощью ножниц.

Выделение ДНК

Протокол №1. Выделение ДНК с использованием набора реагентов PrepFiler BTA Forensic DNA Extraction Kits.

Для полноты лизирования образцов в буфер ВТА Prep Filer через 4 и 14 ч после начала инкубации вносили дополнительно 7 мкл протеиназы К (20 мг/мл) и 3 мкл 1М дитиотреитола (DTT). В остальном процесс выделения ДНК соответствовал инструкции фирмы-производителя. Объем элюирующего буфера составлял 50 мкл.

Протокол №2. Выделение ДНК с использованием комплекса реагентов Tissue and Hair Extraction Kit и DNA IQ System.

Модификация инструкции к набору Tissue and Hair Extraction Kit состояла в следующем: время инкубации при температуре 56 °С увеличили до 18 ч, а через 14 ч после начала инкубации добавляли повторно 10 мкл протеиназы К (18 мг/мл) и 10 мкл 1М DTT. Объем элюирующего буфера составлял 50 мкл.

Протокол №3. Методику фирмы-производителя для выделения ДНК из волос и ногтей к набору QIAamp DNA Investigator Kit применяли без изменений. Объем элюирующего буфера составлял 50 мкл.

Результаты и обсуждение

В ходе выполнения экспертных исследований в Институте криминалистики в течение ряда лет проводили анализ ДНК, выделенной из фрагментов и срезов ногтей. ДНК выделяли различными способами: сначала методом фенолхлороформной экстракции, затем с использованием указанных ранее наборов для выделения ДНК.

Результаты количественной оценки препаратов показали, что при использовании протокола №2 значение концентрации ДНК в среднем не превышает 1 нг/мкл, тогда как в препаратах, полученных по протоколам №1 и №3, содержание ДНК, как правило, выше. Соответственно была предпринята попытка подобрать такие коммерческие наборы для выделения ДНК, которые позволяли бы выделять максимальное количество ДНК при исследовании микрофрагментов ногтей. Для этого сравнили содержание выделенной ДНК в препаратах, полученных из предварительно взвешенных образцов ногтей 32 лиц.

Навески образцов ногтей составляли от 0,9 до 15,6 мг. Количество выделенной ДНК:

— протокол №1 — от 0,57 до 20,15 нг/мкл;

— протокол №2 — от 0,03 до 2,36 нг/мкл;

— протокол №3 — от 0,23 до 41 нг/мкл.

На рис. 1 Рисунок 1. Количественная оценка препаратов ДНК, полученных различными способами. показано распределение концентрации ДНК в препаратах, полученных из навесок до 6 мг.

Оказалось, что при одном и том же количестве исходного материала по протоколам №1 и №3 выделено больше ДНК, чем по протоколу №2, причем разница составила до 20 раз.

Срезы ногтей являются материалом, в котором возможна значительная деградация ДНК. Кроме того, количество ядерных структур в них может колебаться у различных индивидуумов. Для сравнения эффективности выделения различными способами была проведена экстракция ДНК из разных навесок фрагментов ногтей, отобранных от одного лица.

Решали определенную задачу: определить диапазон масс навесок материала. При исследовании большого количества навесок ногтевых пластин (около 1 г), вероятно, не возникнет проблемы выделить ДНК в количестве, достаточном для последующего генотипирования. В экспертной практике наибольшую сложность представляют микрообъекты, поэтому основное внимание уделили малым навескам: 1, 2, 3, 5, 7 мг (рис. 2). Рисунок 2. Количественная оценка препаратов ДНК, полученных из материала одного лица различными способами.

При использовании протоколов №1 и №3 из всех навесок было экстрагировано количество ДНК, достаточное для проведения генотипирования (от 0,04 до 1,28 нг/мкл). В растворах, полученных по протоколу №2, ДНК человека не обнаружили. Такие результаты эксперимента, на наш взгляд, можно объяснить низким содержанием ДНК в ногтевых пластинах конкретного донора, что привело к выделению относительно небольшого количества ДНК из всех исследованных навесок.

Сходные результаты получены при выделении ДНК из ногтевой пластины трупа тремя указанными способами. На исследование был представлен фрагмент гнилостно измененного пальца, мягкие ткани которого были непригодны для генетического исследования, а костный фрагмент фаланги пальца очень мал. Результаты количественной оценки препаратов ДНК показаны в таблице.

Эффективность выделения ДНК во всех случаях подтверждалась последующим генотипированием. Полученные генетические профили оценивали по сбалансированности наработки амплифицируемых фрагментов. Соотношения высот пиков флюоресценции на электрофореграммах составляли не менее 0,8 для гетерозигот и от 1,4 до 3,5 для коротких и длинных локусов.

Выводы

Таким образом, при наличии достаточно большого количества материала (более 5 мг) можно использовать любой из трех наборов. В то же время при работе с микроколичествами ногтей предпочтительнее применять набор PrepFiler BTA Forensic DNA Extraction Kits или QIAamp DNA Investigator Kit.

В целом использование коммерческих наборов для выделения ДНК позволяет отказаться от метода фенолхлороформной экстракции при молекулярно-генетическом исследовании фрагментов ногтевых пластинок. Время выделения ДНК не превышает 20 ч, а исходная навеска биоматериала в количестве 1—3 мг позволяет получить высокоочищенный препарат ДНК. Количество выделенной ДНК достаточно не только для генотипирования по локусам STR, но и для проведения дополнительных генетических исследований.

Калаев В.Н. 1 Землянухина О.А. 2 Карпеченко И.Ю. 2 Карпеченко К.А. 2 Кондратьева А.М. 1 Вепринцев В.Н. 1 Карпеченко Н.А. 1 Карпова С.С. 1

Проведено исследование по изучению эффективности применения стандартной методики выделения ДНК из растений рода Rhododendron. Оценку методики выделения проводили на основе трех параметров: возможной деградации ДНК в ходе электрофоретического разделения полученных препаратов в агарозном геле, концентрация и чистота полученных образцов, анализируемых по спектрофотометрическим характеристикам препаратов, и воспроизводимость результатов ПЦР. Показано, что стандартный метод выделения нуклеиновых кислот не является пригодным по отношению к растениям данного рода и дальнейшие исследования не возможны по причине сильной деградации образцов и содержания большого количества примесей, препятствующих проведению реакций рестрикции и ПЦР. Для получения качественного препарата ДНК были изменены некоторые этапы и подобраны оптимальные температурные, временные и концентрационные параметры методики, что, в свою очередь, позволило получить образец дезоксирибонуклеиновой кислоты без признаков деградации и примесей.

2. Баранов О.Ю., Каган Д.И. Микросателлитный анализ берёзы повислой // Молекулярная и прикладная генетика. – 2005. – Т. 1. – С. 157.

3. Боронникова С.В., Тихомирова Н.Н. Анализ генетической изменчивости популяций двух редких лекарственных видов рода Adonis с использованием ISSR-маркеров // Известия ТСХА. – 2008. – №1. – С. 86–94.

4. Остроумов Л.А., Просеков А.Ю., Архипов А.Н., Мудрикова О.В. // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. – 2010. – Т. 12, №4 (3). – С. 722–724.

5. Падутов В.Е., Баранов О.Ю., Воропаев Е.В. Методы молекулярно-генетического анализа. – Минск: Юнипол, 2007. –176 с.

8. Edwards K., Johnstone С., Thomson С.А. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis // Nucleic Acids Res. – 1991. – Vol. 19. – P. 1349.

9. Lee H.C., Wei Y.H. Mitochondrial alterations, cellular response to oxidative stress and defective degradation of proteins in aging // Biogerontology. – 2001. – Vol. 2. – P. 231–244.

10. Poms R.E., Glossl J., Foissy H. Increased sensitivity for detection of specific target DNA in milk by concentration in milk fat // European Food Research and Technology. – 2001. – Vol. 213. – Р. 361–365.

В настоящее время наряду с традиционными методами изучения растений в селекционных, генетических и таксономических исследованиях всё большее значение приобретают методы, основанные на выяснении изменчивости ДНК и ее структуры. Данные методы позволяют с высокой точностью определить характер изменчивости генетического материала, что даёт возможность уже на ранних стадиях развития растения выявить особи с наиболее ярко выраженными полезными качествами [4]. Однако для проведения молекулярно-генетических исследований, связанных с изучением структуры генов, на первом этапе необходимо получить чистый препарат ДНК без признаков деградации и примесей.

Было экспериментально установлено, что лучшие результаты получаются при выделении ДНК из почек и молодых листьев растения [5], в то время как во всех мертвых клетках (например, в ксилеме покрытосемянных) наблюдается деградация ДНК, что делает невозможным проведение дальнейшего анализа. Особое внимание необходимо уделять и видовой принадлежности изучаемого образца, так как растения разных видов характеризуются различными физиологическими и биохимическими особенностями как, например, присутствием различных веществ (полисахаридов, танинов, полифенолов и их хинонокисленных продуктов), создающих значительные примеси в препаратах нуклеиновых. Физико-химические свойства подобных веществ в определенной степени совпадают со свойствами нуклеиновых кислот, что затрудняет их полное отделение от ДНК и обусловливает низкое качество препаратов, что делает непригодным их дальнейшее использование.

Объектом наших исследований стали растения рода рододендрон (Rhododendron L.). Это многочисленный род растений семейства Вересковые (Ericaceae), включающий около тысячи видов вечнозеленых, полулистопадных и листопадных кустарников и деревьев. Рододендроны лишь сравнительно недавно стали у нас по-настоящему популярны. Есть несколько причин этому: во-первых, некоторые из них - единственные вечнозеленые лиственные растения, зимующие в нашем климате. Во-вторых, цветение рододендронов - удивительное зрелище, с которым мало что может сравниться [7]. Известно также, что рододендроны содержат большое количество дубильных веществ, что необходимо принимать во внимание при проведении молекулярно-генетических исследований растений данного рода, требующих выделения ДНК.

Целью настоящей работы явилось исследование возможности применения стандартной методики выделения ДНК из растений на представителях рода Rhododendron и оптимизации данной методики для конкретного объекта.

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили листья растений рододендрона.

Процесс выделения ДНК включает несколько этапов.

Первый этап связан с разрушением клеточных структур. Для разрушения мембран используется механическое воздействие путем растирания ткани в специальных гомогенизаторах или вручную с помощью пестика. Однако следует отметить, что при выборе разрушающего агента и метода разрушения клеточных структур важно учитывать возможность повреждения молекул ДНК самими агентами или условиями выделения [1].

На следующем этапе выделения ДНК проводится ее очистка от разрушенных клеточных структур, высоко- и низкомолекулярных соединений. Удаление белков осуществляют путем их денатурации с помощью фенола, хлороформа, ацетона и некоторых солей.

Важным этапом при выделении ДНК является ее осаждение. Наиболее часто используемый метод концентрирования - осаждение ее изопропанолом или этанолом [5].

В ряде случаев требуется очистка препаратов от содержания РНК. Это достигается применением фермента РНК-азы [2].

Задачей данного исследования явилось изучение возможности применения стандартной методики выделения ДНК из растений [10] на представителях рода Rhododendron. Основным способом получения ДНК является метод, основанный на использовании ЦТАБ (цетилтриметиламмоний бромид)-буфера. Данная методика основана на том, что при высоких концентрациях солей нуклеиновые кислоты образуют стабильные и растворимые соединения с цетилтриэтиламмоний бромидом. При снижении концентрации соли NaCl ниже 0,4 М комплекс ЦТАБ - нуклеиновая кислота выпадает в осадок. После разрушения клеток белки денатурируют и экстрагируют смесью хлороформа с изоамиловым спиртом. ЦТАБ удаляют путем осаждения этанолом (ЦТАБ растворим в этаноле, а ДНК нет). В данной методике предполагается использование четырех буферных растворов (2x ЦTAБ буфер, 5x ЦTAБ буфер, буфер для преципитации и HS-TE буфер) следующего состава:

Институт криминалистики Центра специальной техники ФСБ России, Москва

Сравнение эффективности выделения ДНК из ногтевых пластин с помощью коммерческих наборов реагентов

Журнал: Судебно-медицинская экспертиза. 2013;56(4): 27-29

Институт криминалистики Центра специальной техники ФСБ России, Москва

При использовании первых двух наборов ДНК сорбируют на магнитных частицах, а 1 /₃ его — на мембране колонок.

Материал и методы

Исследуемые образцы

2. Ногтевая пластина трупа, мягкие ткани которого находились в значительной степени разложения.

Выделение ДНК

Протокол №1. Выделение ДНК с использованием набора реагентов PrepFiler BTA Forensic DNA Extraction Kits.

Протокол №2. Выделение ДНК с использованием комплекса реагентов Tissue and Hair Extraction Kit и DNA IQ System.

Результаты и обсуждение

Навески образцов ногтей составляли от 0,9 до 15,6 мг. Количество выделенной ДНК:

— протокол №1 — от 0,57 до 20,15 нг/мкл;

— протокол №2 — от 0,03 до 2,36 нг/мкл;

— протокол №3 — от 0,23 до 41 нг/мкл.

Выводы

к.б.н. Ведерников В.Е. (Лаборатория молекулярной диагностики ООО "Вега" ГК "Алкор Био")

ВВЕДЕНИЕ

Чувствительность полимеразной цепной реакции (ПЦР) в значительной степени зависит от эффективности выделения ДНК из клинического материала. Недостаток информации об особенностях различных методов пробоподготовки и отсутствие четких утвержденных требований к характеристикам наборов для экстракции нуклеиновых кислот (НК) может привести к затруднениям при выборе методики для решения конкретной задачи.

В настоящее время на территории России для диагностики наследственных и инфекционных заболеваний широко используется метод ПЦР. Одним из ключевых моментов эффективной молекулярно-генетической диагностики является этап пробоподготовки. Соблюдение выработанных годами клинико-диагностической практики требований к каждой процедуре этого этапа крайне необходимо для получения достоверных результатов. Чувствительность метода ПЦР в значительной степени зависит от эффективности выделения ДНК из клинического материала. На данный момент наиболее востребованными в клинической практике методами экстракции ДНК являются: сорбционный метод, метод на основе спиртового осаждения и экспресс-метод экстракции ДНК. Каждый из перечисленных подходов имеет свои достоинства и недостатки. К сожалению, выбор того или иного метода пробоподготовки основан, прежде всего, на таких его характеристиках, как стоимость, продолжительность и трудоемкость анализа, а не на соответствии выбранной методики поставленной задаче. Это связано с отсутствием доступной аналитической информации в этой области и четких утвержденных рекомендаций по пробоподготовке.

В данной статье мы дадим сравнительную характеристику наиболее применяемых подходов к экстракции НК, а также расскажем о принципах их работы и своих разработках в области пробоподготовки.

Экспресс экстракция на основе температурного лизиса – методика, позволяющая в кратчайшие сроки получить пригодный для постановки ПЦР-анализа препарат НК.

Принцип метода: Клинический образец помещается в пробирку с лизирующим буфером, затем подвергается термической обработке, в процессе которой происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение НК. С помощью последующего центрифугирования нерастворимые компоненты осаждаются на дне пробирки, а надосадочная жидкость (супернатант), содержащая ДНК, используется для проведения ПЦР.

В настоящее время экспресс-методика выделения ДНК получила широкое распространение. Встречаются данные о том, что экспресс-метод успешно применяется для выделения ДНК таких возбудителей, как Mycobacterium tuberculosis [1], C h lamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium и других инфекций передающихся половым путем (ИППП). В то же время при оценке эффективности выделения ДНК HPV (папилломавирус человека) из соскобов со слизистой урогенитального тракта пациентов с использованием сорбционного и экспресс-метода отмечалось значительное увеличение эффективности в случае выделения сорбционным методом [2]. Это связано с тем, что в процессе пробоподготовки экспресс методом не производится очищение препарата НК от посторонних примесей и концентрирования в малом объеме, что, в совокупности приводит к значительному снижению чувствительности анализа. Так, при экстракции НК из 100 мкл урогенетального соскоба на стадии добавления образца к лизирующему буферу происходит разбавление исходного материала в 4-6 раз без последующей стадии концентрирования.

Применение. В большей степени данная методика подходит для молекулярно-генетических исследований, когда требуется лишь качественный анализ, а не определение наличия целевой последовательности инфекционного агента с максимальной чувствительностью.

Образцы. Для проведения анализа подходят образцы только с низким содержанием ингибиторов, такие как урогенетальные соскобы, мазки, слюна и др.

Спиртовое осаждение – широко распространенная методика пробоподготовки, в основе которой лежит агрегация НК в присутствие соли и спирта.

Принцип метода. После осаждения спиртом НК отделяется от раствора центрифугированием. Осадок, содержащий целевую НК, отмывается 70% этиловым спиртом с последующим центрифугированием. После удаления супернатанта осадок подсушивается и растворяется в водном буфере. Роль соли в протоколе экстракции состоит в том, что её положительно заряженные ионы нейтрализуют отрицательный заряд на сахаро-фосфатном скелете НК, приводя к снижению растворимости последних в воде. В водном растворе электростатическое притяжение положительно заряженных ионов и отрицательно заряженных фосфатных групп подчиняется закону Кулона и зависит от диэлектрической константы раствора. Вода имеет большую диэлектрическую константу, что затрудняет взаимодействие ионов, тогда как этанол с гораздо более низкой диэлектрической константой способствует взаимодействию положительно заряженного иона и фосфатной группы, что приводит к выпадению НК в осадок. Нужно отметить, что НК менее растворима в изопропаноле, чем в этаноле, соответственно для ее осаждения требуются меньшая концентрации изопропанола (для выпадения НК в осадок достаточно присутствия 35 % изопропанола и 0,5 М соли, в то время как этанола требуется около 75% при той же концентрации соли). Таким образом, к образцу изопропанола необходимо добавлять 0,7-1 объема образца, а этанола 2,-2,5 объема. Следовательно, изопропанол предпочтительнее использовать, если есть ограничения по объему используемого пластика (например, есть возможность добавить только один объем образца). В ряде протоколов экстракции предлагается проводить осаждение (преципитацию) НК при пониженной температуре (-20°С). Однако, есть исследователи не согласные с этой теорией; по результатам их экспериментов температура инкубации со спиртом не имеет значительного влияния на выход продукта. Главенствующая роль, по их мнению, должна быть отведена продолжительности центрифугирования [3].

При выделении малых количеств НК (менее 100 нг) для визуализации осадка и улучшения процесса преципитации рекомендуется использовать соосадители, такие как гликоген, линейный полиакриломид или декстран [4]. В некоторых протоколах экстракции предлагается добавлять соосадители непосредственно к осадителю (этанолу или изопропанолу) [5]. Делать этого, однако, не следует, так как соосадитель, попадая непосредственно в спирт, начинает образовывать центры нуклеации в отсутствие НК и, соответственно, при последующем смешивании с образцом в меньшей степени способствует агрегации НК. Соосадитель, таким образом, следует добавлять непосредственно в лизирующий буфер или к образцу.

На предпоследнем этапе выделения ДНК проводится добавление 70% этанола для отмывки осадка от остатков солей. Важно, чтобы отмывка проводилась именно водным раствором спирта, так как соли хорошо растворяются в воде и в гораздо меньшей степени в спирте. Кроме того, использование 70% этанола препятствует переходу НК в водную фазу.

На завершающем этапе процедуры происходит растворение НК в водном буфере обычно при температуре 56-65°С и вортексировании, что необходимо для лучшего растворения осадка.

Объем анализируемого образца 200-500 мкл.

Применение. Данная методика подходит как для молекулярно-генетических исследований, так и для диагностики инфекционных заболеваний. Однако, в силу продолжительности и сложности анализа метод спиртового осаждения получил наибольшее распространение в исследовательских молекулярно-генетических лабораториях и в судебно-медецинских лабораториях, где требуется выделение аналитических количеств ДНК.

Образцы. Для проведения процедуры можно использовать широкий спектр биологических обрзцов, однако при проведении анализа важно учитывать, что спиртовое осаждение приводит к преципитации не только НК, но и белков, что в свою очередь затрудняет получение чистого препарата НК из образцов с высоким содержанием белков, таких как биоптаты или цельная кровь. Наиболее простым путем решения проблемы с нежелательными примесями является уменьшение объема анализируемого образца, однако такой подход не применим, если необходимо получить результат с максимальной чувствительностью.

Сорбционная экстракция – методика, в основе которой лежит избирательная сорбция на поверхности силики в присутствие хаотропной соли. Ингибиторы и другие компоненты клинического материала остаются в растворе. С помощью центрифугирования силика с НК осаждается, а супернатант c ингибиторами ПЦР удаляется. Серия последующих отмывок обеспечивает получение высокоочищенного препарата НК.

Принцип метода. Как и во всех процедурах экстракции НК на первом этапе проводится лизис биологического образца. Чаще всего для лизиса используются хаотропные агенты, например гуанидин тиоцианат, которые дестабилизируют водородные связи, ван-дер-ваальсовы и гидрофобные взаимодействия. В таких условиях растворимость НК в воде снижается, а белки денатурируют. Кроме хаотропных солей в лизирующем буфере чаще всего присутствуют детергенты, которые способствуют растворению и лизису белков.

Хаотропная соль необходима не только для лизиса, но и для процесса сорбции НК. Также для усиления процесса сорбции в некоторых протоколах рекомендуют добавлять спирт [6]. Нужно отметить, что сорбция ДНК на силике под действием хаотропных солей – процесс, который по-прежнему вызывает много споров. Однако среди всех существующих точек зрения на процесс взаимодействия ДНК с силикой можно выделить несколько основных.

Первая точка зрения [7] состоит в том, что сорбция ДНК на силике происходит за счёт образования катионных мостиков между силанольными группами, расположенными на поверхности силики и фосфатными группами ДНК. Известно, что в растворе при рН 6 – 8 поверхность силики отрицательно заряжена, как и фосфатные группы НК. Из-за электростатического отталкивания взаимодействие между ними невозможно. Однако при добавлении хаотропной соли отрицательный заряд экранируется. В таких условиях молекулы НК сорбируются на поверхности силики за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий.

Вторая точка зрения опирается на свойства хаотропных агентов [8]. Известно, что молекула НК в растворе покрыта гидратной оболочкой. Попадая в раствор, молекулы хаотропной соли активно разрушают водородные связи, присоединяя к себе воду. В итоге молекула ДНК, лишённая своей гидратной оболочки, становится гидрофобной. То же самое происходит с поверхностью силики. В итоге между ДНК и силикой возникают гидрофобные взаимодействия, и идёт процесс сорбции.

Согласно еще одной точке зрения [9,10] основным механизм взаимодействия ДНК и силики является образование водородных связей между водой и молекулами НК. Подобные выводы были сделаны после выявления зависимости между количеством адсорбированной ДНК и диаметром пор силики. Предполагается, что сорбция происходит за счет взаимодействия гидратных оболочек образованных поверхностью поры и молекул НК. Авторы подчеркивают, что НК лишь частично включается в поры, а основная часть молекул торчит на поверхности. В данной теории не ясным остаётся роль хаотропных солей, присутствующих в растворе. Вследствие этого наиболее вероятными вариантами механизма сорбции представляются первые два, которые являются взаимодополняющими.

Необходимо также отметить, что процесс сорбции лучше всего идет при высокой ионной силе раствора, показателях рН 3,5-6,5 (оптимум рН 5) и температуре выше 37 °С [11].

После завершения этапа лизиса/сорбции производится центрифугирование, при этом силика вместе с НК образует осадок. Супернатант, содержащий примеси, удаляется, осадок силики/НК, содержащий остаточные количества солей и белков, сначала промывается раствором хаотропной соли, затем от одного до трех раз 70% этиловым спиртом. Спиртовые отмывки необходимы для полного удаления остатков хаотропной соли.

Объем анализируемого образца. Метод сорбции позволяет эффективно выделять НК как из стандартных объемов клинического материала (например, 100 мкл урогенитального соскоба), так и из больших объемов биопроб – от 1 мл и более, при этом не требуется дополнительных стадий концентрирования биологического материала.

Применение. Данный метод подходит как для молекулярно-генетических исследований, так и для обнаружения различных инфекций с максимальной чувствительностью.

Образцы. Метод сорбции на силике позволяет качественно отмывать образец от всевозможных примесей, ингибиторов, которые могут привести к ухудшению реакции. Благодаря этому, данная методика является универсальной – она подходит для любых типов биопроб.

РАЗРАБОТКИ КОМПАНИИ АЛКОР БИО

На данный момент в компании Алкор Био разрабатываются наборы для пробоподготовки на основе всех трех подходов к экстракции НК:

1. Набор для экспресс-выделения нуклеиновой кислоты на основе температурного лизиса, в состав которого введен дополнительный компонент – соосадитель ингибиторов, повышающий качество очистки образца в процессе центрифугирования. Данная разработка находится на стадии экспериментального макета.

2. Набор на основе спиртового осаждения находится на стадии регистрации в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения и социального развития. Эту надежную, проверенную, хорошо работающую методику, нашедшую широкое применение в клинической практике мы адаптировали для выделения геномной ДНК из сухих пятен крови, которые широко используются при проведении скрининга новорожденных.

3. Набор для выделения нуклеиновых кислот методом магнитоуправляемой сорбции на силике - наиболее интересная и перспективная разработка Принципиальным отличием от классического протокола здесь является то, что в качестве сорбента используются магнитные частички, покрытые силикой. Это дает очень важное преимущество: промывать осадок можно без использования центрифуги, с использованием только магнитного штатива. Данный метод позволяет работать без дорогостоящего оборудования, а для проведения процедуры экстракции НК таким способом требуется значительно меньше времени, чем при использовании других методик. Важным преимуществом магнитоуправляемого выделения является возможность автоматизации процесса. Компания Алкор Био (совместно с нашими партнерами) разработала собственные магнитные частицы, которые отличаются высоким качеством покрытия и соответствуют лучшим зарубежным аналогам. Эти частицы выращиваются и затем определенным образом покрываются оболочкой силики, на которую в дальнейшем сорбируются НК. Данная разработка проходит аттестацию и планируется к выпуску.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из основных этапов проведения молекулярно-генетических исследований, основанных на методе ПЦР, является выделение ДНК. От выбранного метода выделения зависит чувствительность анализа и как следствие надежность и достоверность получаемых результатов.

Наиболее распространенным методом выделения ДНК в клинико-диагностических лабораториях для диагностики инфекций является экспресс экстракция. Это в первую очередь обусловлено низкой стоимостью анализа и простотой его исполнения. Однако, чувствительность данного подхода в ряде случаев недостаточна для применения с целью диагностики ИППП, что в свою очередь обуславливает долю ложноотрицательных результатов.

Метод спиртового осаждения, обладая высокой чувствительностью, не получил широкого распространения для диагностики ИППП в связи со сложностью и продолжительностью анализа. Тем не менее, этот метод является незаменимым для выделения аналитических количеств ДНК.

Универсальным подходом выделения ДНК является сорбционная экстракция, которая, наряду с высокой чувствительностью, характеризуется простотой исполнения. Более того, использование данного метода выделения НК позволит автоматизировать процесс, что особенно актуально для клинико-диагностических лабораторий с большим потоком исследований. Использование магнитных частиц собственного производства снижает стоимость анализа, что, как мы надеемся, будет способствовать широкому распространению этого наиболее эффективного и качественного метода выделения НК.

3. Zeugin JA, Hartley JL (). "Ethanol Precipitation of DNA". Focus -1985. -Vol. 7(4). -P. 1–2.

7. Rother D., Sen T., East D., Bruce I.J. // Nanomedicine (Lond). -2011. -Vol. 6(2). -P. 281-300.

8. Mason P. E. [et al.] // J. PNAS -2003. -Vol. 100(8). -P. 4557–4561.

10. Li X., Zhang J., Gu H. // Langmuir -2011. -Vol. 27(10). -P. 6099-6106. 11. Melzac K. A., Sherwood C. S., Turner R. F. B., Haynes C. A.// J. of colloid and interface science -1996. -Vol. 181. -P. 635–644.

Читайте также: